Summary
House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
Abstract
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
Introduction
Hus Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) celler er avledet fra det auditive organ i en transgen muse 1,2. Inkubasjon av en celle fra denne transgene mus ved 33 ° C / 10% CO 2 (permissive betingelser) induserer ekspresjon av et gen immortalizing som utløser de-differensiering og proliferasjon akselerert; flytting av cellene til 39 ° C / 5% CO 2 (ikke-permissive betingelser) føre til redusert proliferasjon, differensiering og, i det minste i tilfellet med HEI-OC1, celledød 2,3.
HEI-OC1 celler ble klonet og karakterisert i vårt laboratorium over et tiår siden, og innledende studier indikerte at de uttrykker spesifikke markører for cochlea hårceller som Prestin, myosin 7a, Atoh1, BDNF, calbindin og calmodulin, men også markører for å støtte cellene som connexin 26 og fibroblast-vekstfaktor-reseptor (FGF-R) 2. Det ble derfor foreslått at HEI-OC1 kunne representere en common stamfar for sensoriske og støtte celler av orgel av Corti to. Parallelle studier ga sterke bevis for at arketypiske ototoksiske stoffer som cisplatin, gentamicin og streptomycin indusert caspase-3-aktivering i disse cellene, mens narkotika betraktes som ikke-ototoksisk, som penicillin, ikke 2,3. Derfor ble denne cellelinje foreslått som et in vitro-system for å undersøke de cellulære og molekylære mekanismer som er involvert i ototoxicity og for screening av potensielle ototoxicity eller otoprotective egenskaper av nye farmakologiske midler. Det er anslått at HEI-OC1 celler har blitt brukt i mer enn hundre og femti studier publisert i løpet av de siste ti årene.
Mens du ser på potensialet pro-apoptotisk effekt av ulike rusmidler var den store målet for de fleste studier med denne cellelinjen, har andre viktige celleprosesser som autofagi og senescence akkurat begynt å bli undersøkt i HEI-OC1 celler 4-7. Jegna fersk studie fra vårt laboratorium 8, brukte vi HEI-OC1 celler til å samle et omfattende sett av data om celledød, overlevelse, spredning, alderdom og autofagi indusert av forskjellige farmakologiske stoffer som brukes ofte i klinikken. Vi har også sammenlignet noen av responsene til HEI-OC1-celler med de fra HEK-293 (humane embryonale nyreceller) og HeLa (human epitel-celler) som fikk identisk behandling. Våre resultater viste at HEI-OC1-celler reagerer på hvert medikament på en karakteristisk måte, med en særegen dose- og tidsavhengig følsomhet til minst en av de mekanismene som studeres. Vi har også lagt vekt på at studie som en korrekt tolkning av de eksperimentelle resultatene vil kreve å utføre parallelle studier med mer enn en teknikk 8.
I en annen studie undersøkte vi bruken av HEI-OC1 celler for å vurdere den funksjonelle responsen Prestin, motoren protein av cochlea ytre hårcellene (OHCs) 9 </sopp>. Vi har rapportert flowcytometri og konfokale laserskanningsmikroskopistudier på mønsteret av Prestin ekspresjon, så vel som ikke-lineære kapasitans (NLC) og helcelle-lapp klemstudier i HEI-OC1-celler dyrket ved ettergivende (P-HEI-OC1) og ikke- givende (NP-HEI-OC1) forhold. Våre resultater tydet på at både total Prestin ekspresjon og plasmamembran lokalisering økning av en tidsavhengig måte i NP-HEI-OC1-celler. Interessant nok har vi også funnet at økningen i Prestin lokalisering på plasmamembranen til NP-HEI-OC1-celler korrelerte med en reduksjon i Na + K + ATPase, som translocated fra plasmamembranen til cytoplasma uten vesentlige endringer i total celle-ekspresjon. I tillegg demonstrerte vi at P-HEI-OC1 celler har en robust NLC forbundet til Prestin motorisk funksjon, som reduseres når tettheten av Prestin molekyler tilstede i plasmamembranen økt. Til sammen disse resultatene støtter sterkt nytten av HEI-OC1 celler for å undersøke auditiv proteiner.
I denne videoen artikkelen beskriver vi hvordan kultur HEI-OC1 celler, hvorfor det er praktisk å bruke celler vokser givende forhold (P-HEI-OC1) for cytotoksisitetstester studier, hvordan man skal vurdere mekanismen / s legemiddelindusert cytotoksisitet og hvordan å utføre elektrofysiologiske studier (f.eks patch-clamp, ikke-lineær kapasitans (NLC)) for å undersøke funksjonelle egenskaper Prestin, den molekylære motor av cochlea OHCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne rapporten beskriver vi hvordan kultur HEI-OC1 celler og bruke dem til å vurdere mekanismer for narkotika-indusert cytotoksisitet og å undersøke funksjonelle egenskaper Prestin, den molekylære motor av cochlea OHCs. De tekniske fremgangsmåter, men er generelt nok til å være lett tilpasses forskjellige studier.
Alle protokollen beskrevet her krever riktig bruk av veletablerte cellekulturteknikker 10. Akkurat som med en hvilken som helst annen cellelinje, som arbeider …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
Materials
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
- Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
- Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
- Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
- Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
- Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
- Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
- Celis, J. E. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).
- Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
- Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
- Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
- Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
- Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
- Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
- Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin’s Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
- Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).
