Murine flexorpeesletsel en Repair Surgery

Summary

Flexorpezen in de hand worden vaak gewond, wat leidt tot een verminderde handfunctie. Echter, het littekenweefsel genezende reactie niet goed gekarakteriseerd. Een muizenmodel van flexorpees genezing is hier gedemonstreerd. Dit model kan algemeen begrip van het genezingsproces te verbeteren en therapeutische benaderingen om de genezing te verbeteren beoordelen.

Abstract

Pees verbindt het skelet spieren en botten, het vergemakkelijken van de beweging van bijna het hele lichaam. In de hand, flexorpezen (FTS) maken buiging van de vingers en de algemene handfunctie. Verwondingen aan de FTS komen vaak voor, en bevredigende genezing wordt vaak aangetast als gevolg van teveel littekenweefsel en verklevingen tussen de pees en het omringende weefsel. Er is echter weinig bekend over de moleculaire en cellulaire componenten van FT reparatie. Daartoe een muizenmodel van FT reparatie die vele aspecten van genezing bij de mens, waaronder verminderde beweeglijkheid recapituleert en verminderde mechanische eigenschappen, ontwikkeld en eerder beschreven. Hier een diepgaande demonstratie van deze chirurgische procedure verschaft, waarbij doorsnijding en daaropvolgende reparatie van de flexor digitorum longus (FDL) pees in de achterpoot van muizen. Deze techniek kan worden gebruikt om lineage analyse van verschillende celtypen te voeren, de effecten van gen winst of verlies-van-functie getest, en de effi testenciëntie van farmacologische interventies in het genezingsproces. Er zijn echter twee belangrijke beperkingen aan dit model: i) het FDL pees in het middengedeelte van het muizen achterpoot, waarbij de doorsnijding en reparatie optreden, wordt niet omgeven door een synoviale schede. Derhalve Dit model houdt geen rekening met de mogelijke bijdrage van de mantel om de littekenvorming proces. ii) Om de integriteit van de reparatieplaats beschermen, is de FT vrijgegeven op het myotendinous knooppunt, het verminderen van de mechanische krachten van de pees, waarschijnlijk bijdragen aan de grotere littekenvorming. Isolatie van voldoende cellen van het granulatieweefsel van de FT tijdens het genezingsproces voor flowcytometrische analyse moeilijk gebleken; cytologie centrifugatie aan deze cellen concentraat is een alternatieve methode, en zorgt voor het genereren van celpreparaten, waarop immunofluorescentie labeling kan worden uitgevoerd. Met deze methode kwantificering van cellen of eiwitten van belang tijdens FT genezing mogelijk.

Introduction

Flexor pezen in de hand werken samen met de flexor spieren van de onderarm en digitale omhulsels flexie van de cijfers en grijpfunctie van de hand mogelijk. Flexorpezen lopen langs de palmaire aspect van de hand; deze relatief oppervlakkige locatie resulteert vaak in verwondingen aan de flexorpezen tijdens trauma aan de kant. Pezen genezen door middel van een littekenweefsel respons in plaats van regeneratie van normaal peesweefsel ^1. Hoewel dit littekenweefsel biedt continuïteit van de pees, wordt de functie drastisch afgenomen ten opzichte van een gezonde pees. Pees-littekenweefsel composieten worden gekenmerkt door een verminderde mechanische eigenschappen ^1, waardoor het gerepareerde pezen meer kans op scheuren. Bovendien littekenweefsel mist de organisatie van het natieve collageen pees vezelstructuur, resulterend in een toename van de pees grootte en massa. Gezien de anatomische beperkingen van de pees-hulseenheid zelfs bescheiden toename pees grootte kunnen drastisch rodeUCE de glijdende functie van de pees, en dus digit bereik van de beweging en handfunctie.

Voorafgaand aan de verwondingen 1960 om de pezen, met name in zone II van de hand, niet routinematig gerepareerd vanwege de ernstige complicaties bij de genezing die zich tijdens deze reparatie ^2. Dit gebied van de hand werd aangeduid als 'niemandsland' ^3. Echter, zijn verbeteringen in chirurgische technieken, hechtdraad patronen en fysiotherapie revalidatie protocollen sterk verbeterde resultaten van flexorpees reparaties ^2. Ondanks deze vooruitgang, tot 40% van reparaties leiden tot voldoende adhesie formatie handfunctie ⁴ belemmeren. Daarom is een biologische benadering bij genezing verbeteren. Helaas, zeer weinig bekend over de pees genezingsproces op cellulair en moleculair niveau. Derhalve was het doel een murine model dat kan worden gebruikt om de fundamentele understandin ontwikkelen ter verbeteringg de cellulaire en moleculaire componenten van buigpees genezing en littekenvorming respons, als middel om nieuwe therapeutische targets te identificeren om genezing te verbeteren.

Grotere diermodellen zijn instrumenteel in het bevorderen van begrip van de flexorpees genezingsproces geweest. Honden en konijnen studies hebben aangetoond dat zowel de intrinsieke als extrinsieke herstellend vermogen van pezen ^5,6, het belang van vroegtijdige gecontroleerde passieve beweging minimaliseren adhesies opzichte van immobilisatie ^7, evenals de effecten van verschillende patronen op de hechtdraad genezingsproces ^{8 , 9.} Bovendien heeft het hondenmodel bruikbaar bij testen translationele weefselmanipulatie benaderingen genezing ¹⁰ verbeteren. Er zijn echter een aantal belangrijke voordelen in het gebruik van een muizenmodel opzichte van een groot diermodel, zoals de relatieve kosten, beschikbaarheid van muis specifieke reagentia en het gemak van generating globaal Knock-outs of weefsel-specifieke schrapping / overexpressie constructen. Bovendien is de functionele overeenkomst tussen menselijk en muizen ten opzichte flexorpezen ¹¹ geven de potentiële bruikbaarheid bij de ontwikkeling van een muismodel.

Ontwikkeling van een muizenmodel van flexorpees doorsnijding en reparatie bootst vele aspecten van klinische genezing, met inbegrip van de vorming van overvloedige littekenweefsel en verminderde mechanische eigenschappen. De hier beschreven model is een echte herhaling van klinische praktijk door doorsnijden van de FDL de myotendinous knooppunt om de reparatieplaats beschermen. Bovendien heeft dit model geen rekening met de bijdrage van synoviale cellen huls wordt genezing, aangezien er geen synoviale schede die het middengedeelte van de pees waar de reparatie plaatsvindt. Ondanks deze beperkingen heeft dit model het voordeel van het genereren bereik van beweging te beperken adhesies, die nog moet worden aangetoond bij muizenmodellen die meer closely benaderen de klinische scenario. Dit model is gebruikt om knock-out muismodellen ^12,13 beoordelen en om verschillende farmacologische benaderingen om de genezing ^14-17 te verbeteren testen. Histologische analyses van dit model, middels immunohistochemie en in situ hybridisatie, kunnen belangrijke inzichten in de lokalisatie van belangrijke genen en eiwitten bieden tijdens de genezing. Echter, histologie geeft slechts een dwarsdoorsnede ruimtelijke analyse en maakt kwantificering niet mogelijk het gehele weefsel. Flowcytometrie is een meer kwantitatieve benadering, maar slechts een zeer beperkt aantal cellen kunnen worden geïsoleerd uit de genezing peesweefsel in het muismodel, en dit aantal verder af tijdens fixatie, permeabilisatie en wasstappen. Neemt dit in rekening flowcytometrie wordt een benadering onhaalbaar als gevolg van het aantal dieren dat nodig zou zijn. Een alternatieve methode moet de meerderheid van dit kleine celpopulatie behouden omverder karakteriseren genezing milieu. De methode die wordt gebruikt om dit te bereiken, hier afgebeeld, houdt de concentratie van de geïsoleerde cellen via cytologie centrifugeren op een glasplaatje, gevolgd door immunocytochemie. In de onderhavige studie EDU (5-ethynyl-2'deoxyuridine een thymidine analoog) incorporatie en naderhand coderen werd gebruikt om de relatieve proliferatieve toestand van cellen te bepalen op de genezing plaats. Deze benadering kan worden toegepast om de effectiviteit van farmacologische behandelingen testen celproliferatie, gen knock-out of overexpressie, of verschillende celpopulaties identificeren en te kwantificeren.

Protocol

De Universitaire Commissie Animal Research aan de Universiteit van Rochester keurden alle dierproeven. Ten-12 weken oude vrouwelijke C57BL / 6J muizen werden gebruikt. 1. Voorbereiding van de dieren voor flexorpees Surgery (~ 15 min) Autoclaaf chirurgische instrumenten te steriliseren, draag steriele handschoenen in, en handhaven van een steriele operatiekamer veld. Verdoven de muis via intraperitoneale injectie (ip) met een volume van ketamine (80 mg / kg) en xylazine (…

Representative Results

Flexor digitorum longus (FDL) spieren in de kuit, werkt om de cijfers van de muis achterpoot buigen via de flexorpees (blauwe omtrek in figuur 1A en histologisch figuur 2A), die proximaal loopt van de myotendinous knooppunt en eindigt in de distale vingerkootjes. In dit model van flexorpees genezing, is de FDL pees doorgesneden en gerepareerd in het midden van de voet, proximaal van de vertakking in de cijfers van de achterpoot (rode pijlen, Figu…

Discussion

De chirurgische procedure voor een muizenmodel van volledige doorsnijding en reparatie van de flexor digitorum longus pees wordt in deze studie. Daarnaast een nieuwe toepassing van concentratie kleine celpopulaties met cytologie centrifuge blijkt, waardoor kwantitatieve immunocytochemische analyse van de cellulaire omgeving tijdens flexorpees genezing. Dit model van flexorpeesherstel toont een reproduceerbare genezende reactie, die kan worden gebruikt om wijzigingen in het genezingsproces behulp knockout modellen of far…

Materials

Surgical preparation
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	000664
Ketamine	Hospira	NDC# 0409-2051-05
Xylazine	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorphine	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0.9% sodium chloride irrigation	Hospira	NDC# 0409-6138-03	For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions
1ml syringe	BD	309659
30G needle	BD	305106
Povidone-Iodine solution	Aplicare	82-226
70% ethanol
Puralube vet opthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools
Portable balance 200g	Ohaus	SP202
Spring scissors	Fine Science Tools	15124-12
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Needle holders	Fine Science Tools	91201-13
Micro spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Micro needle holders	Fine Science Tools	12061-02
5-0 nylon sutures	Ethicon	668G
8-0 microsurgery nylon sutures	Ethicon	2808G
Lab-Line histology slide warmer	Barnstead International	26025
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytospin method
Collagenase Type I, lyophilized	Life Technologies	1700-017
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technologies	9998S
1X PBS	Thermo Fisher	10010-023
Cytology funnels	Fisher HealthCare	10-354
HistoBond+ microscope slides	VWR	16005-110
Cytospin 2 centrifuge	Shandon	SH-CYTO2
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunocytochemistry
Slide staining tray with black lid	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Life Technologies	C10639	Includes EdU and  Hoeschst 33342
Immedge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond mounting medium	Thermo Fisher	P36970
Glass coverslips 24x50mm #1.5
Clear nail polish