Murine Flexor Tendon blessures et chirurgie de réparation

Summary

tendons fléchisseurs de la main sont souvent blessés, conduisant à la fonction de la main avec facultés affaiblies. Cependant, la réponse de cicatrisation du tissu cicatriciel ne sont pas bien caractérisés. Un modèle murin de tendon fléchisseur de guérison est démontré ici. Ce modèle peut améliorer la compréhension globale du processus de guérison et d'évaluer les approches thérapeutiques pour améliorer la guérison.

Abstract

Tendon relie le muscle squelettique et de l'os, ce qui facilite le mouvement de la quasi-totalité du corps. Dans la main, les tendons fléchisseurs (FTS) permettent la flexion des doigts et de la fonction générale de la main. Les blessures aux FTs sont communs, et la guérison satisfaisante est souvent altérée en raison de tissus et des adhérences entre le tendon et les tissus environnants cicatrice en excès. Cependant, on sait peu sur les composants moléculaires et cellulaires de FT réparation. À cette fin, un modèle murin de FT réparation qui récapitule de nombreux aspects de la guérison chez les humains, y compris les troubles de l'amplitude des mouvements et une diminution des propriétés mécaniques, a été développé et décrit précédemment. Voici une démonstration en profondeur de cette intervention chirurgicale est prévue, impliquant transection et réparation ultérieure du tendon fléchisseur des orteils (FDL) dans la patte arrière murin. Cette technique peut être utilisée pour effectuer une analyse de la lignée des différents types de cellules, d'évaluer les effets du gain ou de la perte du gène de fonction, et de tester l'efficacité des interventions pharmacologiques dans le processus de guérison. Cependant, il y a deux principales limites à ce modèle: i) le tendon FDL dans la partie médiane de la patte arrière murin, où le transection et la réparation se produisent, ne sont pas entouré par une gaine synoviale. Par conséquent, ce modèle ne tient pas compte de la contribution potentielle de la gaine au processus de formation de cicatrice. ii) Afin de protéger l'intégrité du site de réparation, le FT est libéré à la jonction myotendineuse, ce qui diminue les forces mécaniques du tendon, a probablement contribué à l'augmentation de la formation de cicatrices. L'isolement de cellules suffisantes provenant du tissu de granulation du FT pendant le processus de guérison pour une analyse cytométrique en flux a révélé difficile; cytologique centrifugation pour concentrer ces cellules est une autre méthode utilisée et permet de générer des préparations de cellules sur lesquelles marquage immunofluorescent peut être effectuée. Avec cette méthode, la quantification des cellules ou des protéines d'intérêt au cours de la guérison FT devient possible.

Introduction

tendons fléchisseurs dans le travail de la main, de concert avec les muscles fléchisseurs de l'avant-bras et les gaines numériques pour permettre la flexion des doigts et de la fonction de préhension de la main. tendons fléchisseurs courent le long de la face palmaire de la main; cet endroit relativement superficielle entraîne souvent des blessures aux tendons fléchisseurs pendant un traumatisme à la main. Tendons guérissent par une réponse d' un tissu cicatriciel au lieu de la régénération du tissu normal du tendon ^1. Bien que ce tissu cicatriciel assure la continuité du tendon, la fonction est considérablement diminué par rapport au tendon sain. Composites de tissus Tendon-cicatrice se caractérisent par des propriétés mécaniques affaiblies ^1, ce qui rend les tendons réparés plus susceptibles de se rompre. En outre, le tissu cicatriciel n'a pas l'organisation de la structure des fibres de collagène de tendon natif, ce qui entraîne une augmentation de la taille du tendon et d'encombrement. Compte tenu des contraintes anatomiques de l'unité tendon-gaine, même une légère augmentation de la taille du tendon peut considérablement rougeUCE la fonction de glissement du tendon, et donc plage de chiffres de mouvement et la fonction de la main.

Avant les blessures du 1960 aux tendons fléchisseurs, en particulier dans la zone II de la main, ne sont pas systématiquement réparées en raison des complications graves dans la guérison qui se posent avec ces réparations ^2. Cette zone de la main a été appelé «la terre de personne» ^3. Cependant, l' amélioration des techniques chirurgicales, des motifs de suture et des protocoles de réhabilitation de physiothérapie ont considérablement amélioré les résultats du tendon fléchisseur réparations ^2. Malgré ces progrès, jusqu'à 40% des réparations entraînent la formation d'adhérence suffisante pour empêcher la fonction de la main ^4. Par conséquent, une approche biologique est nécessaire pour améliorer la guérison. Malheureusement, on sait très peu sur le processus de guérison du tendon au niveau cellulaire et moléculaire. Ainsi, l'objectif était de développer un modèle murin qui pourrait être utilisé pour améliorer la understandin fondamentaleg des composants cellulaires et moléculaires de fléchisseur guérison du tendon et la réponse de la formation de cicatrices, comme un moyen d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la guérison.

modèles animaux plus grands ont contribué à améliorer la compréhension du processus de guérison du tendon fléchisseur. Études de Canine et le lapin ont démontré à la fois la capacité de guérison intrinsèque et extrinsèque des tendons fléchisseurs ^5,6, l'importance du mouvement passif tôt contrôlée pour minimiser la formation d'adhérence par rapport à l' immobilisation ^7, ainsi que les effets des différents motifs de suture sur le processus de guérison ^{8 , 9.} En outre, le modèle canin a été utile pour tester des approches d'ingénierie tissulaire translationnelle pour améliorer la guérison ^10. Cependant, il existe plusieurs avantages importants à l'aide d'un modèle murin par rapport à un grand modèle animal, y compris le coût relatif, la disponibilité des réactifs spécifiques de souris et de la facilité de génération globale KNOCk-out ou constructions délétion / surexpression spécifiques de tissus. En outre, les similitudes fonctionnelles entre les humains et les souris en ce qui concerne les tendons fléchisseurs ¹¹ indiquent l'utilité potentielle dans le développement d' un modèle murin.

Développement d'un modèle murin de tendon fléchisseur transection et de réparation imite de nombreux aspects de la guérison clinique, y compris la formation de tissu cicatriciel abondante et des propriétés mécaniques avec facultés affaiblies. Le modèle décrit ici est pas un vrai récapitulation de la pratique clinique en raison de transection du FDL à la jonction myotendineuse afin de protéger le site de réparation. En outre, ce modèle ne tient pas compte de la contribution des cellules synoviales de la gaine à la réponse de cicatrisation, comme il n'y a pas de gaine synoviale recouvrant la partie médiane du tendon se produit lorsque la réparation. Malgré ces limites, ce modèle a l'avantage de la gamme de production d'adhérences de mouvement de limitation, qui doit encore être démontrée dans des modèles murins que plus de closely rapprochant le scénario clinique. Ce modèle a été utilisé pour évaluer les modèles knock-out souris ^12,13, et de tester différentes approches pharmacologiques pour améliorer la guérison ^14-17. analyse histologique de ce modèle, par immunohistochimie et hybridation in situ, peut fournir des indications importantes pour la localisation des gènes et des protéines clés au cours de la guérison. Cependant, l'histologie ne donne qu'une analyse spatiale en coupe transversale et ne permet pas de quantification dans l'ensemble du tissu entier. La cytométrie en flux est une approche plus quantitative, mais seulement un nombre très limité de cellules peuvent être isolées à partir du tissu de tendon de guérison dans le modèle de souris, et ce nombre est encore diminué au cours des étapes de fixation, perméabilisation et lavage. Prenant cela en compte, écoulement devient cytométrie une approche irréalisable en raison du nombre d'animaux qui seraient nécessaires. Une autre méthode est nécessaire pour préserver la majorité de cette petite population de cellules dans le butpour caractériser davantage le milieu de guérison. La méthode utilisée pour ce faire, ici, concerne la concentration des cellules isolées par centrifugation cytologique sur une lame de verre, suivie par immunocytochimie. Dans la présente étude EdU (5-éthynyl-2'deoxyuridine, un analogue de la thymidine) l'incorporation et l'étiquetage ultérieur a été utilisé pour déterminer l'état prolifératif relatif de cellules sur le site de guérison. Cette approche peut être appliquée pour tester l'efficacité des traitements pharmacologiques sur la prolifération cellulaire, le gène knock-out ou d'une surexpression ou d'identifier et de quantifier des populations de cellules différentes.

Protocol

Le Comité de l'Université sur la recherche animale de l'Université de Rochester a approuvé l'ensemble des expérimentations animales. Dix-12 souris C57BL femelle / 6J ont été utilisés. 1. Préparation des animaux pour la chirurgie Flexor Tendon (~ 15 min) instruments chirurgicaux autoclaves pour stériliser, porter des gants stériles tout au long, et de maintenir un champ opératoire stérile. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale (i…

Representative Results

Le long fléchisseur des orteils (FDL) musculaire, situé dans le mollet, agit pour fléchir les chiffres de la patte arrière de la souris via le tendon fléchisseur (indiqué en bleu sur la figure 1A, et montré histologiquement à la figure 2A), qui fonctionne de manière proximale de la myotendineuse jonction et se termine par les phalanges distales. Dans ce modèle de tendon fléchisseur guérison, le tendon FDL est sectionnée et réparé à la mi-…

Discussion

La procédure chirurgicale pour un modèle murin de transection complète et la réparation du tendon fléchisseur des orteils est présenté dans cette étude. En outre, une nouvelle application de la concentration de petites populations de cellules avec la cytologie centrifugeuse est démontrée, permettant une analyse immunocytochimique quantitative de l'environnement cellulaire pendant la guérison du tendon fléchisseur. Ce modèle de tendon fléchisseur de réparation démontre une réponse de guérison reprod…

Materials

Surgical preparation
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	000664
Ketamine	Hospira	NDC# 0409-2051-05
Xylazine	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorphine	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0.9% sodium chloride irrigation	Hospira	NDC# 0409-6138-03	For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions
1ml syringe	BD	309659
30G needle	BD	305106
Povidone-Iodine solution	Aplicare	82-226
70% ethanol
Puralube vet opthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools
Portable balance 200g	Ohaus	SP202
Spring scissors	Fine Science Tools	15124-12
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Needle holders	Fine Science Tools	91201-13
Micro spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Micro needle holders	Fine Science Tools	12061-02
5-0 nylon sutures	Ethicon	668G
8-0 microsurgery nylon sutures	Ethicon	2808G
Lab-Line histology slide warmer	Barnstead International	26025
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytospin method
Collagenase Type I, lyophilized	Life Technologies	1700-017
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technologies	9998S
1X PBS	Thermo Fisher	10010-023
Cytology funnels	Fisher HealthCare	10-354
HistoBond+ microscope slides	VWR	16005-110
Cytospin 2 centrifuge	Shandon	SH-CYTO2
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunocytochemistry
Slide staining tray with black lid	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Life Technologies	C10639	Includes EdU and  Hoeschst 33342
Immedge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond mounting medium	Thermo Fisher	P36970
Glass coverslips 24x50mm #1.5
Clear nail polish