Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS<__ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID

Summary

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Abstract

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

Introduction

Protéines liant l'ARN (RBP) représentent environ 10% de S. protéines cerevisiae ^1,2 et environ 15% de protéines de mammifères ^3-5. Ils sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que le traitement de l'ARNm post-transcriptionnelle et de régulation, la traduction, la biogenèse des ribosomes, ARNt aminoacylation et modification, remodelage de la chromatine, et plus encore. Un sous – groupe important de la RBP est les protéines d'ARNm de liaison (mRNP) ^6,7. Au cours de l' ARNm maturation, différentes RBP lient la transcription et la médiation de son traitement nucléaire, l' exportation hors du noyau, la localisation cellulaire, la traduction et la dégradation ^6-8. Ainsi, l'ensemble distinct de pratiques commerciales restrictives liées à une transcription particulière à tout point de temps détermine son traitement et, finalement, son sort.

L'identification des pratiques commerciales restrictives associées à un ARNm pourrait améliorer considérablement notre compréhension des processus qui sous-tendent leur régulation post-transcriptionnelle. Diverse génétique,, Les méthodes bio – informatiques biochimiques et microscopiques ont été utilisées pour identifier des protéines impliquées dans la régulation de l' ARNm (revu dans ^9-11). Cependant, seulement quelques-unes de ces méthodes ne permettent l'identification de protéines associées à un ARNm cible particulier. Il est à noter la levure Trois système hybride (Y3H), qui utilise l'ARNm d'intérêt comme appât pour cribler une banque d'expression dans les cellules de levure. Les clones positifs sont généralement observés à travers une expression de sélection de croissance ou reporter ^12-14. Le principal avantage de cette méthode est le grand nombre de protéines qui peuvent être scannés dans un environnement cellulaire et la capacité de mesurer la force de l'interaction ARN-protéine. Les inconvénients comprennent le nombre relativement élevé de résultats faussement positifs en raison de la liaison non spécifique, et le potentiel élevé de résultats faussement négatifs dus, en partie, à repliement de la proie de protéine de fusion ou l'ARN appât.

Une alternative à l'approche génétique est purifi affinitécation de l'ARN avec ses protéines associées. Poly A contenant des ARNm peut être isolé en utilisant des colonnes d'oligo dT et de leurs protéines associées sont détectées par spectrométrie de masse. L'interaction ARN-protéine est conservée dans son contexte cellulaire par réticulation, ce qui rend à courte portée des liaisons covalentes. L'utilisation de la colonne oligo dT donne une vue globale de l'ensemble du protéome qui est associé à une poly A-ARNm contenant ^3,5,15. Toutefois, cela ne constitue pas une liste des protéines qui sont associées à un ARNm particulier. Très peu de méthodes sont disponibles pour accomplir une telle identification. La méthode PAIRE implique la transfection d'acide nucléique avec la complémentarité à l'ARNm cible ^16,17. L'acide nucléique est également attaché à un peptide, ce qui permet de réticuler RBP à proximité immédiate du site d'interaction. Après réticulation, l'acide RBP-peptide-nucléique peut être isolé et soumis à une analyse protéomique. Récemment, une méthodologie fondée sur aptamère étaitappliquée avec succès à des extraits de lignées cellulaires de mammifères ^18. Un aptamère d'ARN avec une meilleure affinité pour la streptavidine a été développée et fusionnée à une séquence d'intérêt (élément riche en AU (ARE) dans ce cas). L'aptamère-ARE L'ARN a été fixé à des billes de streptavidine et on le mélange avec le lysat cellulaire. Les protéines qui est associée à la séquence sont ont été purifiés et identifiés par spectrométrie de masse (MS). Bien que cette méthode a détecté des associations qui se produisent en dehors des paramètres cellulaires ( par exemple, in vitro), il est susceptible d'être modifiée ultérieurement , de manière à introduire les aptamères dans le génome et permettre ainsi l'isolement des protéines associées à l'ARNm tandis que dans le milieu cellulaire ( par exemple in vivo). Dans la levure, où les manipulations génétiques sont bien établies, la méthode RaPID (développé dans le laboratoire du professeur Jeff Gerst) fournit une vue des associations in vivo ^19. RaPID combine la MS2- spécifique et forte liaison de la protéine d'enveloppe de MS2 (CP) à la séquence d'ARN de MS2 et du domaine de liaison à la streptavidine (SBP) à la streptavidine billes conjuguées. Cela permet une purification efficace des ARNm MS2-marqués par des billes de streptavidine. En outre, l'expression de 12 copies de MS2 boucles permet jusqu'à six MS2-CPs se lier simultanément à l'ARN et d'accroître l'efficacité de son isolement. Ce protocole a donc été proposé pour permettre l'identification de nouvelles protéines d'ARNm associé à la fois les échantillons éluées sont soumises à une analyse protéomique par spectrométrie de masse.

Nous avons récemment utilisé RaPID pour identifier de nouvelles protéines associées à la levure PMP1 ARNm ^20. PMP1 ARNm a été montré précédemment à être associée à la membrane du RE et de sa région 3 'non traduite (UTR) a été trouvé pour être un déterminant majeur dans cette association ^21. Ainsi, les pratiques commerciales restrictives qui lient PMP1 3 'UTR sont susceptibles de jouer un rôle important dans sa localisation. Rapide suivie chromatographe liquidey-spectrométrie de masse / spectrométrie de masse (LC-MS / MS) a abouti à l'identification de nombreuses nouvelles protéines qui interagissent avec PMP1 ^20. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de la méthodologie RaPID, des contrôles importants qui doivent être faites, et des conseils techniques qui peuvent améliorer le rendement et la spécificité.

Protocol

Remarque: Insérez une séquence composée de 12 MS2 sites de liaison (boucles MS2; MS2L) dans le locus génomique désiré, habituellement entre le cadre de lecture ouvert (ORF) et 3 'UTR. Un protocole détaillé pour cette intégration est prévue ailleurs 22. Vérifier une insertion correcte et à l' expression par PCR, analyse de Northern ou par RT-PCR 20,23. Il est important de vérifier que l'intégration ne sont pas intervenus avec la synthèse du 3'UTR. En outre, un MS2-CP p…

Representative Results

RaPID permet l'isolement d'un ARN cible spécifique avec ses protéines associées. Critique pour son succès est de garder l'ARN intact, autant que possible, de façon à obtenir une quantité suffisante de protéines. Pour déterminer l'efficacité de l' isolement et de la qualité de l' ARN, on effectue une analyse de Northern (figure 1A). analyse Northern a l'avantage de rendre compte directement l'efficacité et la qualité des RaPID….

Discussion

Diverses méthodes utilisent l'isolement des ARNm spécifiques pour identifier leurs protéines associées ^{11,34 35.} Ces méthodes sont applicables in vitro et in vivo des stratégies pour sonder les interactions ARN-protéine. Incuber les méthodes in vitro avec l' ARN transcrit de manière exogène lysat cellulaire pour capturer RBP et isoler les complexes RNP ^36,37. Une approche efficace de ce type a été présenté récemment, ce qui a permis l&#39…

Materials

Tris	sigma	T1503
SDS	bio-lab	1981232300
DTT	sigma	D9779
Acidic Phenol (pH 4.3)	sigma	P4682
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)	sigma	P1944
Chloroform	bio-lab	3080521
Formaldehyde	Frutarom	5551820
Glycine	sigma	G7126
NP-40	Calbiochem	492016
Heparin	Sigma	H3393
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)	Sigma	P7626
Leupeptin	Sigma	L2884
Aprotinin	Sigma	A1153
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T9003
Pepstatin	Sigma	P5318
DNase I	Promega	M610A
Ribonuclease  Inhibitor	Takara	2313A
Glass Beads	Sartorius	BBI-8541701	0.4-0.6mm diameter
Mini BeadBeater	BioSpec	Mini BeadBeater 16
Guanidinium	Sigma	G4505
Avidin	Sigma	A9275
Streptavidin Beads	GE Healthcare	17-5113-01
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Yeast tRNA	Sigma	R8508
Biotin	Sigma	B4501
Yeast extract	Bacto	288620
peptone	Bacto	211677
Glucose	Sigma	G8270
1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)
0.2 M NaOH
4 x Laemmli Sample Buffer (LSB)			0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.
Hot phenol lysis buffer			10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS
3 M Sodium Acetate pH 5.2
100% and 70% Ethanol (EtOH)
RNase-free water
RaPID lysis buffer			20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease  Inhibitor.
2x Cross-linking reversal buffer			100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
RaPID wash buffer			20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit	Bio-Rad	161-0449	For detecting proteins in polyacrylamide gels
SD selective medium			1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)	Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)		1:5,000
Anti GFP antibody	Santa Cruz	sc-8334	1:3,000
Anti rabbit IgG-HRP conjugated	SIGMA	A9169	1:10,000