Protokoller er beskrevet for fabrikation af nedbrydeligt thermoresponsive hydrogels baseret på hydrazone cross-linking af polymert oligomerer på bulk skala, individuel, og nanoskala, sidstnævnte for forberedelsen af både gel nanopartikler og nanofibers.
Mens forskellige smart materialer har været undersøgt for en lang række biomedicinske anvendelser (f.eks.medicinafgivelse, vævsmanipulering, bioimaging, osv.), er deres endelige kliniske anvendelse blevet hæmmet af manglen på biologisk relevante nedbrydning observeret for mest intelligente materialer. Dette er især sandt for temperatur-responderende hydrogels, som er næsten ensartet baseret på polymerer, der er funktionelt ikke-nedbrydelige (f.eks.poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) eller poly (oligoethylene glycol methylmethacrylat) (POEGMA) ). Som sådan, hvis du vil effektivt oversætte potentialet i thermoresponsive hydrogels at udfordringer af fjernstyret eller stofskifte-regulerede medicinafgivelse, scaffolds celle med afstemmelige celle-materiale interaktioner, theranostic materialer med potentiale for både billedbehandling og medicinafgivelse, og andre sådanne ansøgninger er en metode forpligtet til at gøre hydrogels (hvis ikke fuldt nedbrydeligt) mindst i stand til at renal clearance efter den krævede levetid af materialet. Med henblik herpå beskriver denne protokol forberedelse af hydrolytically-nedbrydelige hydrazone-crosslinked hydrogels på flere længdeskalaer baseret på reaktionen mellem maleinhydrazid og aldehyd-functionalized PNIPAM eller POEGMA oligomerer med molekylær vægte under den renale filtration grænse. Specifikt, metoder til at fabrikere nedbrydelige thermoresponsive bulk hydrogels (ved hjælp af en dobbelt tønde sprøjte teknik), hydrogel partikler (på både individuel ved hjælp af en mikrofluidik platform at lette samtidige blanding og Emulgering af forløber polymerer og nanoskalaen ved hjælp af en termisk drevet samlesæt og danne tvaerbindinger metode), og hydrogel nanofibers (ved hjælp af en strategi for reaktiv electrospinning) er beskrevet. I hvert tilfælde hydrogels med temperatur-responderende egenskaber svarende til dem, der opnås via konventionel frie radikaler cross-linking processer kan opnås, men hydrazone krydsbundet netværk kan være nedbrudt over tid til re-form den oligomere forløber polymerer og muliggøre regnskabsafslutningen. Vi forventer som sådan, disse metoder (som kan være generisk anvendes på alle syntetiske vandopløselige polymer, ikke bare smart materialer) gør det muligt lettere oversættelse af syntetiske smart materialer til kliniske applikationer.
Smart materialer har tiltrukket stor opmærksomhed på grund af deres muligheder til reversible “on-demand” svar til eksterne og/eller miljømæssige signaler. Temperatur-responsive materialer har tiltrukket sig særlig interesse på grund af deres lavere kritisk løsning temperatur (LCST) adfærd, hvilket resulterer i temperatur-drevet nedbør ved temperaturer T > LCST1,2. I forbindelse med thermoresponsive hydrogels, denne lavere kritisk løsning temperatur adfærd er manifesteret ved reversibel hævelse/deaktivere-swelling begivenheder der resultere i temperatur-afstemmelige bulk størrelser (større på T < LCST)3, pore størrelser (større på T < LCST)4og interfacial egenskaber (mere hydrofile på T < LCST)5. Sådanne overgange er blevet bredt anvendt i medicinafgivelse (for eksterne eller miljømæssigt triggerable stof frigive4,6,7), tissue engineering og celle kultur (for thermoreversible celle vedhæftning / delaminering8,9,10), separationer (til switchable membran glasårer og permeabiliteter eller termisk genanvendelige diagnostiske understøtter11,12, 13), mikrofluid processer (for tænd-sluk ventiler regulerer strømmen14,15), og rheologiske modifikatorer (for temperatur-afstemmelige viskositeter16). De hyppigst undersøgte thermoresponsive hydrogels er baseret på poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)17, selv om store (og voksende) arbejde har også gennemført på poly (oligoethylene glycol methylmethacrylat) (POEGMA)2 ,18 og poly(vinylcaprolactam) (PVCL)19,20. POEGMA har tiltrukket sig særlig nylige interesse givet sin forventede forbedrede biokompatibilitet21,22og sin facile til tune LCST adfærd, i hvilke lineært forudsigelig blandinger af monomerer med forskellige antal ethylen oxid gentage enheder i deres sidekæder kan ændre LCST fra ~ 20 ° C til > 90 ° C2,23. Men hver af disse polymerer er udarbejdet af frie radikaler polymerisation og indeholder således en kulstof-kulstof rygrad, betydeligt begrænser potentielle nytte og translatability af sådanne polymerer i forbindelse med biomedicinske anvendelser, hvor nedbrydning (eller i det mindste kapacitet for regnskabsafslutning gennem renale filtration) er typisk et krav.
Som svar på denne begrænsning, vi har for nylig rapporteret udførligt om anvendelsen af hydrazone kemi (dvs., reaktionen mellem maleinhydrazid og aldehyd-functionalized før polymerer) til at forberede nedbrydeligt analoger af thermoresponsive hydrogels24,25,26,27,28,29. Den hurtige og reversibel reaktion mellem maleinhydrazid og aldehyd grupper ved blanding af functionalized forløber polymerer30 giver mulighed for både i situ gellation (aktivering facile injektion af disse materialer uden behov for kirurgisk implantation eller nogen form for ekstern polymerisering stimulus såsom UV bestråling eller kemiske indledning) samt hydrolytisk nedbrydning af nettet på en sats, der er kontrolleret af kemi og tæthed af crosslinking websteder. Derudover ved at fastholde de pre-polymerer, der anvendes til at forberede hydrogels under den renale filtration grænse molekylvægt, nedbrydes hydrogels lavet ved hjælp af denne fremgangsmåde tilbage til oligomere forløber polymerer, der kan blive fjernet fra kroppen25 ,27,28. Kombineret med lav cytotoksicitet og lav inflammatorisk væv respons induceret af disse materialer25,26,27, tilbyder denne tilgang en potentielt oversætbare metode for anvendelse af thermoresponsive Smart hydrogels i medicin, især hvis velkontrollerede nedbrydeligt analoger af sådanne hydrogels på alle længde skalaer (bulk, micro og nano) kan være opdigtet.
I denne protokol beskriver vi metoder til fremstilling af syntetiske thermoresponsive pre polymerer functionalized med kontrolleret antal maleinhydrazid og aldehyd grupper samt metoder til at anvende disse polymerer til at oprette hydrogels med veldefinerede dimensioner på forskellige længdeskalaer. Især dette manuskript beskrives fire forskellige metoder vi har udviklet for at styre blanding af reaktive maleinhydrazid og aldehyd-functionalized før polymerer og dermed skabe thermoresponsive hydrogel netværk med veldefinerede geometrier og morfologier:
Hvis du vil oprette nedbrydeligt bulk hydrogels med definerede størrelser, en templating strategi er beskrevet som de reaktive pre polymerer er indlæst i separate tønder af en dobbelt-tønde sprøjten udstyret på sin outlet med en statisk mixer og efterfølgende Co-extruderede i en silikone formen med den ønskede hydrogel form og dimensioner21,27 (figur 1).
Figur 1 : Skematisk af bulk hydrogel dannelse. Maleinhydrazid og aldehyd-functionalized polymer løsninger (med vand eller vandige buffer) er indlæst i separate tønder af en dobbelt tønde sprøjte og derefter Co-extruderede gennem en statisk mixer i en cylindrisk silikone støber. Hurtig i situ gellation efter blanding former en hydrazone crosslinked hydrogel, der er fritstående (når formen er fjernet) inden for få sekunder til minutter afhængigt af koncentrationen og funktionelle gruppe tæthed af forløber polymerer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Hvis du vil oprette nedbrydeligt gel partikler på mikro-skalaen, en reaktiv mikrofluidik metode er beskrevet i hvilket prækursor polymer løsninger er samtidig blandet og emulgeret ved hjælp af en blød litografi-skabelonbaserede mikrofluid chip design, gør det muligt for den dannelsen af blandet reaktive polymer dråber der efterfølgende gel i situ til form gel mikropartikler med størrelser skabelonbaserede af emulsion (figur 2)31,32.
Figur 2 : Skematisk af gel microparticle dannelse via reaktive mikrofluidik. (A, B) Maleinhydrazid og aldehyd-functionalized polymer løsninger (med vand eller vandige buffer) fodres af sprøjten pumpe i separate reservoirer, der er tilsluttet nedstrøms på tværs af en zig-zag række kanaler designet til at skabe en trykgradient, at forhindre tilbagestrømning. Polymerer er derefter blandes lige før at blive klippet af paraffinolie flyder fra begge sider (også drevet af et sprøjten pumpe) og tvunget gennem en dyse, hvilket resulterer i strøm-fokusere produktion af vandig (polymer løsning) dråber i en kontinuerlig paraffin olie fase (Se (B) en illustration af området dyse og slipværktøj dannelsen processen). En yderligere to paraffin olie fjorde er placeret efter dyse til yderligere separat dråber i samling kanalen giver mulighed for komplet gellation inden partikel fjernelse fra laminar flow, hvorefter den resulterende microparticulate geler er indsamlet i en magnetisk stirred bæger; C billede af droplet generation proces på dysen (Bemærk at maleinhydrazid polymer er mærket som blå til at illustrere blanding)
Oprette nedbrydeligt gel partikler på nanoskala, en termisk drevet reaktive samlesæt metode er beskrevet som en løsning på én af reaktive forløber polymerer (“seed” polymer) er opvarmet til over sin LCST til at danne en stabil nanoaggregate, der er efterfølgende crosslinked ved tilsætning af supplerende reaktive forløber polymer (“crosslinking” polymer); den resulterende hydrazone crosslinked nanogel har en størrelse skabelonbaserede direkte af nanoaggregate (figur 3)28.
Figur 3 : Skematisk af nanogel dannelse via termisk drevet reaktive samlesæt. En vandig opløsning indeholdende (thermoresponsive) maleinhydrazid-functionalized polymer er opvarmet over sin lavere kritisk løsning temperatur til at skabe en stabil uncrosslinked nanoaggregate. Efter, en aldehyd-functionalized polymer føjes til bitmapgenkendelse nanoaggregate via hydrazone bond dannelse og dermed stabilisere nanogel partikel ved afkøling under LCST. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Hvis du vil oprette nedbrydelige nanofibers, er en reaktiv electrospinning teknik beskrevet som en dobbelt tønde sprøjten udstyret med en statisk mixer på sin outlet (som anvendes til fremstilling af bulk hydrogels) er knyttet til en standard electrospinning platform (figur 4 )33.
Figur 4 : Skematisk af hydrogel nanofiber dannelse via reaktive electrospinning. En dobbelt tønde sprøjte med en statisk mixer (indlæst som beskrevet for bulk hydrogels men også herunder en brøkdel af høj molekylvægt poly(ethylene oxide) som hjælpemiddel electrospinning) er monteret på en sprøjten pumpe, med nålen i slutningen af sprøjten forbundet til en høj spænding strømforsyning. Hydrazone crosslinking opstår under fiber spinning proces, således at når streamen rammer collector (enten aluminiumsfolie eller en roterende aluminium disk) nanofibrous morfologi bevares. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Anvendelsen af sådanne metoder til oprettelse af nedbrydeligt smart hydrogel netværk er påvist i denne protokol, ved hjælp af enten PNIPAM eller POEGMA som polymer af interesse; men de grundlæggende metoder beskrevet kan oversættes til enhver vandopløselige polymer, omend med passende justeringer for viskositet og (i tilfælde af den samlesæt nanogel fabrikationsanlæg metode) stabiliteten i pre-polymeren til at danne frø nanoaggregate.
Vi har med succes anvendt alle disse fabrication teknikker til flere polymer systemer ved hjælp af kun små variationer af metoderne beskrevet i detaljer ovenfor for PNIPAM og POEGMA; brugere af disse protokoller skal dog være bevidste om de potentielle problemer, der kan opstå, når andre polymerer erstattes i disse processer. Forøge viskositeten af forløber polymerer kan navnlig negativ indflydelse både processibility (især i metoden mikrofluid) samt effektiviteten af blanding af to forløber polymerer. Derudover skal gellation tidspunktet for polymerer kontrolleres på en sats, der er afhængige af morfologi målrettet for at undgå for tidlig gellation, der tjener til at hæmme flow eller forhindre interdiffusion de reaktive pre polymerer, afgørende for at danne den ønskede homogen gel strukturer. De specifikke begrænsninger af hver strategi, såvel som metoder vi har brugt til at tilpasse disse tilgange til at løse sådanne begrænsninger på hver fabrikation længde skala, er beskrevet nedenfor.
Bulk hydrogels via dobbelt tønde sprøjte Co ekstrudering
Gellation tid er den centrale variabel til kontrol for at sikre effektiviteten af en dobbelt tønde sprøjte teknik for at danne bulk hydrogels. Polymerer, der gel for hurtigt ved kontakt ( 5 s foretrækkes (men ikke påkrævet) for brug af denne teknik; Dette er især vigtigt, hvis Repliker hydrogels er at være støbt til fysiske eller mekaniske analyser til at sikre, at hver hydrogel stemmer har samme sammensætning. Gellation tid kan nemt ændres ved at ændre tæthed af reaktive funktionelle grupper på en eller begge forløber polymerer (lavere funktionsgruppe tæthed fører til langsommere gellation) eller ændre koncentrationen af forløber polymerer bruges til at danne gel ( lavere koncentrationer fører til langsommere gellation)21. Skiftevis, erstatter gruppen (mere reaktiv) aldehyd med gruppen (mindre reaktiv) keton som electrophile i den anvendte agars par betydeligt reducerer tid, gellation uden væsentligt ændring af sammensætningen af den resulterende hydrogel35 ; polymerer tilberedt med blandinger af aldehyd og keton monomere prækursorer kan bruges til at tune gellation tid som ønskede uden at ændre koncentrationen af forløber polymerer, der anvendes (og dermed den masse procentdel af faste stoffer i den resulterende gel dannet).
Vi bemærker også, at de første hydrogel stemmer ikke altid har de samme egenskaber som efterfølgende hydrogels stemmer, en observation tilskrives mindre forskelle i den hastighed, hvormed indholdet af to tønderne faktisk nå en statisk mixer. Som et resultat, vi typisk prime dobbelt tønde sprøjten ved strengpresning en lille (< 0,3 mL) brøkdel af gel før indlede trykstøbning proces for at minimere sådanne variabilitet. Endelig, mens ikke normalt problematisk, når du bruger oligomere syntetiske pre polymerer, viskositet af én eller flere forløber polymer løsninger kan udgøre en udfordring i forbindelse med denne teknik, både for at lette strømmen ved hjælp af simple tommelfinger depression samt fremme af effektiv blanding inden for en statisk mixer. Dog lidt overraskende, selv forløber polymer løsninger med stærkt forskellige viskositeter stadig danne relativt homogene hydrogels ved hjælp af de statisk mixer vedhæftede filer, der er beskrevet i listen over dele (f.eks. PNIPAM med en høj Molekylær vægt kulhydrat26), tyder på, der drejer sig om ineffektive blanding som følge af mis matchede viskositeter kan ikke være væsentlig mindst på bulk-skalaen. Hvis det kræves, kan brugen af en sprøjten pumpe (i stedet for thumb) drev strømmen og/eller brug af en større gauge kanyle ved afgangen hjælpe med at overvinde spørgsmål i forbindelse med presbarhed i disse systemer.
Individuel hydrogels via reaktive mikrofluidik
Det vigtigste skridt tilknyttet mikrofluidik tilgang til gel microparticle fabrikation er priming af mikrofluidik chip med de to reaktive polymerer. Hvis polymerer leveres med forskellige belastninger eller til forskellige priser i chippen, at forskellen i tryk kan køre tilbagestrømning af en forløber polymer løsning i reservoiret (eller i det mindste mod reservoiret) af andre forløber polymer. Dette resulterer i gellation opstrøms fra partikel dannelse, effektivt blokerer strømmen og dermed kræver chip bortskaffelse. Stien torturous præget mellem hver reservoir og blanding skaber en betydelig modstand mod tilbagestrømning; selv en uddannet operatør vil lejlighedsvis gel en chip før en stabil flow regime er opnået. Baseret på vores erfaringer, er mellem 1-2 min typisk forpligtet til at stabilisere strømme efter indledningen af droplet dannelse (som tidens forholdsvis polydisperse gel mikropartikler er produceret); Hvis der ingen problemer er observeret inden for de første 5-10 minutter af operation, er det sandsynligt, at flere timers kontinuerlig monodisperse partikel produktion kan opnås. Brugen af forløber polymerer med relativt godt matchede viskositeter samt ikke-øjeblikkelige gellation gange (mindst > 15 s at foretrække) høj grad hjælper med at undgå sådanne problemer og fremme dannelsen af stabil strømme.
Bemærk at forskellige flow priser spænder fra 0,01-0,1 mL/h i den vandige fase og 1,1-5.5 mL/h i fasen for olie er blevet testet ved hjælp af denne chip design, fører til fabrikation af partikler på størrelsesområde ~ 25-100 µm ifølge shear anvendes på den strøm-fokusere junction; hurtigere strømningshastigheder svare til højere shear og dermed mindre partikler dannet31,32. Varierende olie flow-hastighed samtidig med at holde den samlede vandige strømningshastighed lav (~0.03 mL/h, som nævnt i protokollen) blev fundet for at være mest effektivt at styre gel microparticle størrelse uden at kompromittere enten monodispersity eller levetid på enheden, var som begge observeret at signifikant fald i den højere ende af de citerede samlede vandig strømningshastigheder. Større olie strømningshastigheder (> 5,5 mL/h) til at oprette mindre partikler er mulige, men øget risiko for chip delaminering (en fælles begrænsning stødt med plasma-bonded PDMS mikrofluid chips). Limning chips ved hjælp af en anden metode kan aktivere hurtigere strømningshastigheder og dermed mindre gel microparticle produktion, en strategi, vi er i øjeblikket ved at undersøge. Reducere størrelsen på dysen kan også bidrage til at reducere størrelsen af mikropartikler, der kunne produceres, omend på en forhøjet risiko for for tidlig gellation inden partikel dannelse. Langsommere strømningshastigheder tendens til at føre til ustabilitet og dermed højere polydispersities og en øget risiko for chip gellation; denne begrænsning kan overvindes med en multikanal mikrofluid flow control system, der har højere stabilitet og højere opløsning end standard sprøjte pumper anvendes i denne protokol.
Valg af olie var afgørende for succes i denne protokol, som tungere olier (positiv med hensyn til at forebygge gel microparticle bymæssigt område efter samling) førte til meget mindre konsekvent partikel dannelse på dysen end lys silikone olie rapporteret i i protokollen. Vi hypotesen dette reduceret reproducerbarhed er et resultat af lavere konsistens af sprøjten pumpe tungere olier, fører til mere variabel shear på den blanding tidspunkt. Undgå gel microparticle sammenlægning i samling kolbe var også en udfordring, især straks ved afgangen fra den mikrofluid enhed på hvilket tidspunkt i situ gellation ikke var komplet og store antal af tilgængelige reaktive funktionelle grupper var til rådighed for form broer mellem kolliderede partikler i samling bad. Denne udfordring er rettet af: øge længden af exit-kanal på mikrofluid chip, selv, opretholde gel mikropartikler i laminar flow i en længere periode af tid til at fremme mere komplet gellation; tilføje side kanaler efter dyse til foder mere olie ind i chip og dermed bedre separat gel mikropartikler i denne post blanding kanal uden at det påvirker felterne shear på dysen, selv eller partikel produktion sats; og tilføje en magnetisk mixer samling kolben at undgå gel microparticle bundfældning og opretholde en større gennemsnitlig adskillelse mellem tilstødende partikler. Mens meget langsom geldannende polymerer ville sandsynligvis forbedre enhed stabilitet og minimere problemer med grunding, observeret sådanne systemer også til betydeligt øge risikoen for gel microparticle sammenlægning, som et større antal reaktive funktionelle grupper forbliver ureageret (og herigennem købedygtig form Inter partikel broer) over en længere periode. Som sådan, gellation gange på rækkefølgen af 15-60 s synes at være optimal for denne teknik: langsomt nok til at muliggøre priming men fast nok til at sikre mest reaktive funktionelle grupper der forbruges før gel mikropartikler spændende laminar flow-kanal ind i den samling kolbe.
Endelig er fjernelse af templating olie afgørende for at sikre, at de resulterende partikler egenskaberne smart forventede baseret på sammensætningen af de pre polymerer tilføjet og aktiverer brugen af disse partikler i en biomedicinsk kontekst. Pentan vask fremgangsmåden var meget effektiv i denne henseende til generelle gel microparticle produktion. Men anvendelsen af denne teknik i en direkte biomedicinsk sammenhæng (fx, på chip celle indkapsling) ville kræve fornyet evaluering af denne protokol. Vi har også udforsket brugen af olivenolie, foreslog for at være en mere inert olie i forbindelse med at kontakte celler36, som den dispergens. Mens partikel dannelse var muligt, var gel microparticle populationer væsentligt mere polydisperse end der kunne opnås med mineralsk olie, i det mindste med den aktuelle chip design. Således, mens chippen ser ud til at kunne tilpasses både syntetisk polymer og naturlige polymer gel microparticle dannelse31, et modificeret design kan være forpligtet til at udnytte denne teknik mere bredt på tværs af alle mulige materialer kombinationer.
Nanoskala hydrogels via reaktive samlesæt
Nanogels er blevet dannet ved hjælp af en meget bred vifte af forarbejdning betingelser, herunder forskellige koncentrationer af frø polymer (0,5-2 wt %), forskellige nøgletal for crosslinking:seed polymer (0,05-0,2), forskellige temperaturer (40-80 ° C), forskellige blanding hastigheder ( 200-800 rpm), og forskellige varme gange efter tilsætning af crosslinker polymer (2-60 min)28. Med hensyn til koncentrationer er tendenserne observeret generelt som ville blive forudsagt, som højere koncentrationer af frø polymer føre til større nanogels og højere andele af crosslinker:seed polymer føre til nanogels med højere bitmapgenkendelse tætheder og dermed lavere thermoresponsivities. Det skal understreges, at stigende frø polymer koncentration for høj i sidste ende fører til bulk sammenlægning i modsætning til nanoaggregation, i overensstemmelse med hvad er observeret i den konventionelle frie radikaler nedbør proces for at danne thermoresponsive nanogels3. Kortere varme gange fandtes også for at være gunstige for danner mindre og mere monodisperse partikler. Vi hypotesen om at holde nanoaggregate til længere tid på en temperatur over LCST ene eller begge af forløber polymerer øger sandsynligheden for sammenlægning efter nanogel kollision, med den øgede hydrophobicity af hydrazone bond forhold til enten forløber aldehyd eller maleinhydrazid funktionelle grupper gør denne sammenlægning mere sandsynligt som graden af crosslinking opnåede er øget. I sidste ende, kortere varme gange er gunstige fra en proces perspektiv, som en monodisperse nanogel befolkning kan dannes i så lidt som 2 min efter crosslinker polymer tilføjelse; 10 min blev fundet for at være den længste tid, der kunne konsekvent producerer monodisperse nanogels samtidig tillader til produktion af flere stærkt krydsbundet nanogels. Interessant, er metoden bemærkelsesværdigt ufølsom at blande med næsten identiske partikelstørrelser og partikel størrelse distributioner som følge af blanding med forskellige hastigheder eller endda skalering proces til større mængder. Mens i første omgang overrasket over dette resultat, taler det sandsynligvis til den primære rolle i termodynamik i reguleringen af nanogel produktion.
For at opnå lav polydispersities, synes kolloid stabilitet og graden af hydrering af nanoaggregate at være de vigtigste variabler. For eksempel, føre nanoaggregates tilberedt med mere hydrofile maleinhydrazid-functionalized polymerer som frø i modsætning til de mindre hydrofile aldehyd-functionalized polymerer til nanogels med betydeligt lavere polydispersities. Forskellen mellem den eksperimentelle forsamling temperatur og LCST frø polymer er også kritisk. Opererer ved en temperatur lige over frø polymer LCST ((T-LCST) < 5 ° C) tilbyder den højeste sandsynlighed for monodisperse nanogel dannelse; fungerer godt over LCST skaber flere hydrofobe og skjult nanoaggregates, der er mere tilbøjelige til samlede og mindre sandsynligt at bitmapgenkendelse, mens der opererer under LCST resultaterne i en relativt ikke-compact frø polymer, der ikke kan effektivt eller reproducerbar crosslinked. For den bedste forudsigelse af partikel monodispersity, anbefaler vi først udfører en UV/vis-scanning for at måle indsættende LCST frø polymer og efterfølgende udfører det samlesæt proces ved en temperatur på 1-2 ° C over LCST.
Bemærk at nanogels fremstillet ved hjælp af denne metode kunne frysetørret og redispersed uden nogen forandring i kolloid stabilitet, ofte ikke er muligt for selvsamlede strukturer og efter vores mening kan tilskrives vores crosslinking stabilisering metode. Vi forventer også, at kun frø polymeren skal være thermoresponsive for denne metode til at arbejde; Brug af cross-linking polymerer, der er enten ikke-responderende eller lydhøre over for andre stimuli kan yderligere udvide den ultimative anvendeligheden af denne teknik. Endelig, da blanding af de to reaktive forløber polymerer er i dette tilfælde passiv i modsætning til aktive, gellation tid er langt mindre betydning for proceskontrol i forhold til de andre fabrikation strategier beskrevet. Men selv i denne teknik, holde den samlede crosslinking tid < 30 min er ønskeligt at minimere risikoen for partikel sammenlægning.
Nanofibrous hydrogels via reaktive electrospinning
Kontrollere gellation tid af de reaktive pre polymerer er igen afgørende for succes af gel nanofiber produktion. Især omkring matchende opholdstid forløber polymerer i statisk mixer (kontrolleret ved at ændre strømningshastigheden af løsning fra dobbelt-tønde sprøjte samt længde og tortuosity af en statisk mixer) med bulk gellation tiden forløber polymerer er vigtigt både at bevare spinnability samt sikre effektiv crosslinking af spundet fibre mellem nålen og samler. Hurtigere gellation fører til ineffektive Taylor kegle udvikling og dermed dårlige spinnability, mens langsommere gellation resultater i en vandig opløsning i stedet for en gel, der rammer solfangeren, hvilket resulterer i at sprede og den endelige dannelse af en tynd film gel i stedet for nanofibers. Arbejder på residence gange lidt nedenfor bulk gellation tid har også vist sig for at være effektive (og faktisk bedre til at reducere risikoen for nål tilstopning) da vand fordampning, så løsningen er spundet effektivt koncentrerer sig forløber polymerer i den streame og dermed fremskynder gellation kinetik under spinning-processen. I den samme retning, opererer ved højere nål til opkøber afstande (> 10 cm) er generelt gunstige i denne proces, som kortere afstande reducere den tid, der er tilgængelige for vand fordampning og dermed kræver strengere kontrol over forholdet mellem opholdstid og gellation tid for at bevare et nanofibrous produkt.
Bemærk, at brugen af PEO (eller en anden høj molekylvægt og let electrospun polymer) er afgørende i denne protokol til at fremme nanofiber dannelse, som de korte og stærkt forgrenede POEGMA oligomerer alene ikke kan nå en passende grad af entanglement at fremkalde electrospinning; i stedet behandle electrospray resultater på alle betingelser testet for POEGMA-kun formuleringer (selv om dette muligvis også programmer til at lave nedbrydeligt gel partikler ved hjælp af denne samme kemi). Et minimum PEO koncentration på 1 wt % (1 MDa molekylvægt) er forpligtet til at opretholde et fuldt nanofibrous morfologi. Bemærk at PEO kan fjernes fra fibrene efter en simpel opblødning procedure (deioniseret vand, 24 h) uden at forstyrre integriteten af nanofibrous netværk; på denne måde fungerer PEO mere som en forbigående electrospinning støtte end en væsentlig del af varens endelige nanofibrous. Bemærk også, at forskellige former for samlere, herunder simple aluminiumsfolie (til at oprette tyndt lag hydrogels, der kan delaminere fra solfanger ved iblødsætning) samt en roterende aluminium disk (til at oprette tykkere stilladser) kan bruges sammen med denne samme teknik, forudsat de andre processen variabler at kontrollere hastigheden af gellation, satsen for electrospinning og sats af vand fordampning under electrospinning forbliver uændret.
Interessant, afhængigt af metoden til at forberede de forskellige morfologier er betydelige forskelle blevet observeret i nedbrydning gange af hydrogels fremstillet af de samme hydrogel prækursorer. For eksempel, nedbrydes POEGMA nanofibrous hydrogels langsommere end bulk POEGMA hydrogels med den samme sammensætning trods deres betydeligt højere areal og dermed adgang til vand at hydrolysere hydrazone obligationer. Vi relatere disse forskelle til de iboende kontraster mellem de beskrevne protokoller i form af geometri blanding forløber polymerer, som kan føre til indre gel homogeneities/morfologier, der er væsentligt forskellige eller i situ koncentration af polymer prækursorer på den samme tidshorisont som gellation, særlig relevant i electrospinning på grund af samtidige vand fordampning og crosslinking observeret i denne proces. Mens dette kan noget komplicere valget af forløber polymerer, hvis en polymer er målrettet til brug i hver protokol, kan det også tilbyde en teknisk mulighed for at gøre hydrogels med en kemisk sammensætning, men meget forskellige fysiske egenskaber.
Samlet set de beskrevne metoder giver en strategi for at fabrikere nedbrydelige (eller i det mindste renally clearable) analoger af thermoresponsive polymerer på flere længdeskalaer (bulk, micro og nano) og med flere typer af interne strukturer (partikler eller fibre). Sådanne protokoller løse de vigtigste barrierer for vellykket oversættelse af konventionelt forberedt syntetiske thermoresponsive materialer til den biomedicinske felt: injektionsydelse og nedbrydelighed. Vi fortsætter med at undersøge anvendelsen af sådanne materialer i både medicinafgivelse og tissue engineering applikationer lige fra de fysiske målretning af kræft, transport af stoffer over blod – hjerne barrieren, den terapeutiske levering af proteiner på på bagsiden af øjet, retningsbestemt væksten af væv, thermoreversible vedhæftning og differentiering af celler, blandt andre applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra naturvidenskab og teknisk forskning Rådet i Canada (NSERC), NSERC Opret-IDEM (integreret Design af ekstracellulære matricer) program, 20/20: NSERC oftalmologiske biomaterialer Research Network og Ontario Ministry of Research og Innovation tidlige forsker Awards program er anerkendt.
Chemicals | |||
2,2 – azobisisobutryic acid dimethyl ester | Wako Chemicals | 101138 | |
Di(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (M(EO)2MA) | Sigma Aldrich | 447927 | 188.2 g/mol, n=2 ethylene oxide repeat units |
Oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate (OEGMA475) | Sigma Aldrich | 447943 | 475 g/mol, n=8-9 ethylene oxide repeat units |
Acrylic acid (AA), 99% | Sigma Aldrich | 147230 | |
Thioglycolic acid (TGA), 98% | Sigma Aldrich | T3758 | |
Dioxane, 99% | Caledon Labs | 360481 | |
Nitrogen, UHP grade | Air Liquide | Alphagaz1 765A-44 | |
Adipic acid dihydrazide (ADH), 98% | Alfa Aesar | A15119 | |
N'-ethyl-N-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, x%) | Carbosynth | FD05800 | |
Hydrochloric acid (HCl), 37% | Sigma Aldrich | 320331 | |
Sodium hydroxide (NaOH), 97% | Sigma Aldrich | 221465 | |
Aminoacetyl aldehyde dimethyl acetal, 99% | Sigma Aldrich | 121967 | |
4-Hydroxy-TEMPO, 97% | Sigma Aldrich | 176141 | |
Methacryloyl chloride,97x% | Sigma Aldrich | 523216 | |
Petroleum ether, 95% | Sigma Aldrich | 32047 | |
Magnesium sulfate, 99.5% | Sigma Aldrich | M7506 | |
tert-Butyl methyl ether, >99.0% | Sigma Aldrich | 443808 | |
Phosphate buffered saline | BioShop | PBS405.1 | 1x, pH 7.3-7.5 |
N-isopropylacrylamide, 99% | J&K Scientific | 258717 | Recrystallized from 60% hexanes/40% toluene |
Ethanol, anhydrous | Commerical Alchols | P016EAAN | |
Span 80 | Sigma Aldrich | S6760 | |
Heavy paraffin oil | Caledon Labs | 1326197 | |
Pentane, reagent grade | Caledon Labs | 1/10/7800 | |
Poly (ethylene oxide) average Mv 600,000 | Sigma Aldrich | 182028 | |
Supplies essential for synthesis and hydrogel fabrication | |||
Rotary evaporator | Heidolph | G3 | |
Dialysis tubing (3500 Da molecular weight cut-off) | Spectrum Labs | 28170-166 | Vol/length= 6.4mL/cm |
Double barrel syringe | Medmix | L series | L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio |
Static mixer | Medmix | L series | L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio, 1.5" length |
Silicone rubber sheet, 1/16" thickness | McMaster-Carr | 9010K12, 30A Durometer (Super Soft) | |
Syringe pump | KD Scientific | KDS Legato 200 | Infuse Only Dual Syringe Pump |
High voltage power supply | Spellman | 230-20R | 0 to 20 kV |
Microfluidic Chip Fabrication | |||
Silicon wafer | University Wafer | 2080 | D = 76.2 mm; 380 µm thickness; P-doped; <100> orientation |
SU-8 100 | MicroChem | Y131273 | |
SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | |
Custom 2.5" spincoater | Built in-house | N/A | |
Mask Aligner | KARL SUSS | MJB3 UV400 (with a 276 W lamp) | |
Masterflex L/S 13 Silicone Tubing | Cole Parmer | OF-96400-13 | Peroxide-cured |
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Base | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
High Power Plasma Cleaner | Harrick | PDC-002-HP | |
Characterization Instruments | |||
Mach 1 micromechanical tester | Biomomentum | LB007-EN | |
Cellstar tissue culture 12 well plate | Greiner Bio-one | 665 180 | |
Cell culture insert for 12 well plate | Corning | 08-771-12 | 8 µm pore size |
Optical microscope | Olympus BX51 optical microscope | BX51 | |
Temperature-controlled microscope stage | Linkam Scientific | THMS600 | |
Gel permeation chromatograph (GPC) | Waters | 590 HPLC Pump | Waters Styragel columns (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7.8 mm (ID); 5 mm particles), Waters 410 refractive index detector |
Dynamic light scattering (DLS) | Brookhaven | 90Plus Particle Size Analyzer | |
Transmission electron microscopy (TEM) | TEMSCAN | JEOL 1200EX | Accelerating voltage 100 kV |
Scanning electron microscopy (SEM) | Tescan | Vega II LSU | Accelerating voltage 10 kV |
Microsquisher | CellScale Biomaterials Testing | MS-50M-01 |