のpH依存性活性の検出<em>エシェリヒア・コリ</em>シャペロンHdeB<em>インビトロ</em>と<em>インビボ</em
Summary
この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。
Abstract
細菌は、しばしば、このようなpHの変化、温度、酸化還元状態、露光又は機械力などの環境の変化にさらされています。これらの条件の多くは、細胞内のタンパク質のアンフォールディングを引き起こし、生物の生存に有害な影響を与えます。無関係な、ストレス特異的分子シャペロンのグループは、これらのストレス条件の生存に不可欠な役割を果たすことが示されています。完全に折り畳まれてシャペロン非アクティブなストレスの前にしながら、これらのタンパク質は急速に展開し、特定のストレス条件下でシャペロン活性になります。一度これらの条件付きで無秩序シャペロンは異なる凝集しやすい多数のタンパク質に結合し、活性化し、その凝集を防止し、直接または間接的に非ストレス状態への復帰時にリフォールディングタンパク質を容易にします。それらの活性化とクライアントの認識のメカニズムについてのより詳細な理解を得るための第一のアプローチは、精製およびsubsequenを伴いますインビトロシャペロンアッセイを使用して、これらのタンパク質のTの特徴付け。 生体内ストレスアッセイにおけるフォローアップ独立インビトロの結果で得られたことを確認することが不可欠です。
このプロトコルは、Eのシャペロン活性を特徴づけるために、in vitroおよびdi vivoの方法で説明し大腸菌 HdeB、酸活性化シャペロン。光散乱測定は、インビトロで 、確立されたモデルのクライアントタンパク質、MDHの酸誘発性の凝集を防止するHdeBの能力のための便利な読み出しとして使用しました。分析超遠心分離実験は、非ストレス状態への復帰時のクライアントタンパク質の運命に光を当てるために、HdeBとそのクライアントタンパク質のLDHとの間の複合体形成を明らかにするために適用しました。クライアントタンパク質の酵素活性アッセイは、pHによって誘発されるクライアントの不活性化および再活性化にHdeBの効果をモニターするために行きました。最後に、生存研究はmonitoするために使用されましたin vivoでの HdeBのシャペロン機能の影響をrを。
Introduction
微生物病原体は、酸誘発タンパク質アンフォールディング状態を経験する一般的な自然環境は、その酸性pH食品媒介病原体1に対する有効な障壁として機能する哺乳動物の胃（pH範囲1-4）、です。アミノ酸側鎖のプロトン化に起因するタンパク質のアンフォールディング及び凝集は、生物学的プロセス、損傷細胞構造に影響を与え、最終的に細胞死1,2を引き起こします。細菌のペリプラズムのpHは多孔性の外膜を通過するプロトンの自由拡散にほぼ瞬時に環境pHと平衡するので、グラム陰性細菌のペリプラズムと内側の膜タンパク質は、酸ストレス条件3の下で最も脆弱な細胞成分です。急速な酸の仲介による損傷に対する彼らのペリプラズムプロテオームを保護するために、グラム陰性菌は、酸活性化ペリプラズムシャペロンHdeAとHdeBを利用します。 HdeAは条件付きで無秩序シャペロンであります<sup> 4,5：中性pHでは、HdeAは折り畳まれ、シャペロン不活性な二量体として存在します。 pHが3以下のpHシフトの際に、HdeAのシャペロン機能は、6,7を速やかに活性化されます。 HdeAの活性化は、その単量体への解離、およびモノマー6-8の展開部分を含む深刻な構造変化を、必要とします。一旦活性化されると、HdeAは酸性条件下で展開するタンパク質に特異的に結合します。これは、効果的に低pHでのインキュベーションの間だけでなく、pHを中和時に両方の彼らの凝集を防ぐことができます。 pHを7.0に復帰する、HdeAはATP非依存的にそのクライアントタンパク質のリフォールディングを促進し、その二量体、シャペロン不活性なコンフォメーション9に戻って変換されます。同様に、相同的シャペロンHdeBもシャペロン不活性をpH7.0です。 HdeAとは異なり、HdeBのシャペロン活性は、pH4.0のHdeBが依然として大きく折り畳ま10ダイマーされる条件を、その見かけの最大値に達します。また、さらにpHがコーを下げますHdeBの不活化エス。これらの結果は、それらの広範な相同性にもかかわらず、HdeAとHdeBが彼らの保護シャペロン機能を有する広いpH範囲をカバーすることを可能にする機能的活性化のそれらのモードで異なることを示唆しています。 E.の耐酸性に関与している一つの他のシャペロン大腸菌は中立状態が復元されるまで、折り畳まれていないクライアントタンパク質を安定化させるために表示される、細胞質Hsp31です。 Hsp31の正確な作用モードは、しかし、12謎のままです。このようなサルモネラなどの他の腸内細菌がhdeABオペロンを欠いていることを考えると、他のまだ正体不明のペリプラズムのシャペロンはこれらの細菌11の耐酸性に関与していることが存在するかもしれない可能性が非常に高いです。
ここに提示プロトコルは、 インビトロおよびインビボ10 HdeBのpH依存シャペロン活性を監視することを可能にし、他のシャペロンを調査するために適用することができますHsp31など。あるいは、hdeABの発現を制御する転写因子の複雑なネットワークは、潜在的に、インビボでの応力アッセイにより調べることができます。 インビボでのタンパク質のシャペロン機能を特徴づけるために、異なる実験のセットアップを適用することができます。一つの経路は、タンパク質アンフォールディングストレス条件を適用して表現型のいずれかは、対象の遺伝子を過剰発現または遺伝子の欠失を担持する変異株を特徴付けることです。プロテオミクス研究はシャペロンが存在する場合、ストレス条件下で凝集体はもはやそのタンパク質を同定しないように実施することができる、または特定の酵素に対するシャペロンの影響は、酵素アッセイ14〜16を用いてストレス状態の間に決定することができます。本研究では、すべての主要なEの発現を制御するRpoH熱ショックシグマ因子32を欠いているrpoH欠失株でHdeBを過剰発現することを選びました大腸菌のシャペロンとその削除はSENSを増加することが知られています15のタンパク質のアンフォールディングを引き起こす環境ストレス条件にitivity。 HdeBのインビボシャペロン活性をΔrpoH株のpH感受性を抑制する能力をモニターすることによって決定しました。要するに、ここで紹介するプロトコルは、in vitroならびに in vivoでのコンテキストで酸活性化シャペロンの活性を特徴づけるための迅速かつ簡単な方法を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
活性化およびHdeBのシャペロン機能のメカニズムを研究するために、HdeB大量に発現させ、精製しなければなりません。発現ベクター系の数は、この研究で使用した両方ともたpTrcかのpBADベクターを含む、標的タンパク質の高レベルの産生のために利用可能です。プロモーターはE.のために容易にアクセス可能ですコリ RNAポリメラーゼ、したがって、任意のEにHdeBの強い?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、シャペロンアッセイの彼女の有益な助言のために博士クラウディアCremersに感謝します。ケン・ワンはHdeB精製における彼の技術支援のために認められています。この作品は、ドイツ研究財団（DFG）が提供するポスドク研究フェローシップでサポートされている（航空局へ）ハワード・ヒューズ医学研究所と航空局とUJJ-UDへの健康助成金RO1 GM102829の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| NEB10-beta E. coli cells | New England Biolabs | C3019I | |
| Ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-3 | |
| LB Broth mix, Lennox | LAB Express | 3003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Tris | Amresco | 0826-5kg | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Polymyxin B sulfate | ICN Biomedicals Inc. | 100565 | |
| 0.2 UM pore sterile Syringe Filter | Corning | 431218 | |
| HiTrap Q HP (CV 5 ml) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1153-01 | |
| Mini-Protean TGX, 15% | Bio-Rad | 4561046 | |
| Malate dehydrogenase (MDH) | Roche | 10127914001 | |
| Potassium phosphate (Monobasic) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| F-4500 fluorescence spectrophotometer | Hitachi | FL25 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126-5G | |
| NADH | Sigma | N8129-100MG | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9390-2.5KG | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S397-500 | |
| Lactate dehydrogenase (LDH) | Roche | 10127230001 | |
| Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392764 | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/ |
| Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled | Beckman Coulter | 306493 | |
| AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| Wizard Plus Miniprep Kit | Promega | A1470 | used for plasmid purification (Protocol 5.1) |
| L-arabinose | Gold Biotechnology | A-300-500 | |
| Glycine | DOT Scientific Inc | DSG36050-1000 | |
| Fluorescence Cell cuvette | Hellma Analytics | 119004F-10-40 | |
| Oligonucleotides | Invitrogen | ||
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP set | Invitrogen | 10297018 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL | Millipore | UFC900324 | |
| Centrifuge Avanti J-26XPI | Beckman Coulter | 393127 | |
| Varian Cary 50 spectrophotometer | Agilent Tech | ||
| Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa | Spectrum Laboratories | 132650 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K | Millipore | UFC803024 | |
| SDS | Fisher Scientific | bp166-500 | |
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher | 4375786 |
Riferimenti
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