Detecção da actividade de dependente do pH<em> Escherichia coli</em> Chaperone HdeB<em> In Vitro</em> e<em> In Vivo</em
Summary
Este estudo descreve técnicas biofísicas, bioquímicos e moleculares que caracterizam a actividade acompanhante de Escherichia coli HdeB sob condições de pH ácido. Estes métodos têm sido aplicados com sucesso para outras chaperonas ácido-protectores, tais como HdeA e pode ser modificado para funcionar com os outros acompanhantes e condições de stress.
Abstract
As bactérias são freqüentemente expostos a mudanças ambientais, tais como alterações no pH, temperatura, estado redox, a exposição à luz ou força mecânica. Muitas destas condições causar proteína se desdobrar na célula e ter um impacto negativo sobre a sobrevivência do organismo. Um grupo de chaperonas moleculares independentes, específicos de stress têm sido mostrados para desempenhar papéis essenciais na sobrevivência destas condições de stress. Enquanto totalmente dobrado e acompanhante-inativo antes de stress, estas proteínas se desdobram rapidamente e se tornar acompanhante-ativa sob condições de estresse específicos. Uma vez activadas, estas chaperonas condicionalmente desordenados se ligam a um grande número de proteínas de agregação propensas diferentes, impedir a sua agregação e facilitar, quer directamente ou indirectamente, a proteína de redobragem após o regresso a condições não-tensão. A abordagem principal para ganhar uma compreensão mais detalhada sobre o mecanismo da sua activação e cliente reconhecimento envolve a purificação e subsequent caracterização dessas proteínas chaperonas utilizando ensaios in vitro. Follow-up em ensaios de estresse in vivo são absolutamente essenciais para confirmar independentemente o obtido resultados in vitro.
Este protocolo descreve in vitro e in vivo em métodos para caracterizar a actividade de chaperona E. coli HdeB, uma chaperona activadas por ácido. Medições de dispersão de luz foram utilizados como uma leitura conveniente limite para a capacidade de HdeB para prevenir a agregação induzida por ácido de uma proteína modelo estabelecido cliente, MDH, in vitro. experimentos ultracentrifugação analítica foram aplicados para revelar formação de complexos entre HdeB e sua LDH proteína cliente, para lançar luz sobre o destino de proteínas clientes após o seu regresso a condições não-estresse. ensaios de actividade enzimática das proteínas de cliente foram conduzidos para monitorizar os efeitos da inactivação HdeB no cliente induzida pelo pH e reactivação. Finalmente, os estudos de sobrevivência foram usadas para monitor a influência da função da chaperona HdeB in vivo.
Introduction
Um ambiente natural comum em que agentes patogénicos microbianos experimentar condições de desdobramento da proteína induzida por ácido do estômago de mamífero é (gama de pH 1-4), cujo pH ácido serve como uma barreira eficaz contra agentes patogénicos de origem alimentar 1. Proteína se desdobrar e agregação, que é causada por protonação cadeia lateral de aminoácido, afecta os processos biológicos, danifica as estruturas celulares e, eventualmente, 1,2 provoca a morte celular. Uma vez que o pH do periplasma bacteriano equilibra-se quase instantaneamente com o pH do ambiente devido à livre difusão de protões através da membrana exterior porosa, proteínas da membrana periplasmática e interiores das bactérias Gram-negativas são os componentes celulares mais vulneráveis em condições ácidas com o stress 3. Para proteger sua proteoma periplasmático contra danos mediada pelo ácido rápida, bactérias Gram-negativas utilizar os chaperones peripl�micos ativada por ácido HdeA e HdeB. HdeA é um acompanhante condicionalmente desordenada <sup> 4,5: A um pH neutro, HdeA está presente como um dímero dobrado, a chaperona inactivo. Era uma mudança de pH abaixo de pH 3, função de acompanhante de HdeA é rapidamente activado 6,7. Ativação de HdeA requer profundas mudanças estruturais, incluindo a sua dissociação em monómeros, e a parcial desdobramento dos monômeros 6-8. Uma vez activado, HdeA liga-se a proteínas que se desdobram em condições ácidas. Ele evita eficazmente a sua agregação, tanto durante a incubação a pH baixo, bem como mediante a neutralização do pH. Ao retornar para pH 7,0, HdeA facilita a re-enrolamento de suas proteínas clientes de forma ATP-independente e converte de volta em seu dimérica, conformação acompanhá-inativa 9. Da mesma forma, o HdeB chaperona homóloga também é chaperona inactiva a um pH de 7,0. Ao contrário HdeA, no entanto, a atividade acompanhante de HdeB atinge o seu máximo aparente em pH 4,0, as condições sob as quais HdeB é ainda largamente postas e diméricas 10. Além disso, reduzindo ainda mais os caus pHes a inativação de HdeB. Estes resultados sugerem que apesar da sua extensa homologia, e HdeA HdeB diferem no seu modo de activação funcional que lhes permite cobrir uma ampla gama de pH com a sua função acompanhante de protecção. Um outro chaperona que tem sido implicado na resistência aos ácidos dos E. coli é o Hsp31 citoplasmática, que aparece para estabilizar proteínas desdobradas cliente até que as condições neutras são restaurados. O modo de acção exacto de Hsp31, no entanto, manteve-se enigmática 12. Tendo em conta que outras bactérias enteropatogénicas tais como Salmonella falta o operão hdeAB, é muito provável que outros acompanhantes periplásmicos ainda não identificadas podem existir que estão envolvidos na resistência ao ácido destas bactérias 11.
Os protocolos aqui apresentados permitem monitorizar a actividade de chaperona dependente do pH de HdeB in vitro e in vivo 10 e pode ser aplicado na investigação de outras chaperonastais como Hsp31. Em alternativa, a rede complexa de factores de transcrição que controlam a expressão de hdeAB pode potencialmente ser investigadas pelo ensaio de stress in vivo. Para caracterizar a função de acompanhante de proteínas in vivo, diferentes configurações experimentais podem ser aplicadas. Um caminho é aplicar condições de estresse desdobramento de proteínas e fenotipicamente caracterizar cepas mutantes que ou sobre-expressam o gene de interesse ou carregam uma deleção do gene. Proteomic estudos podem ser conduzidos para identificar quais as proteínas não agregadas sob condições de stress, quando a chaperona está presente, ou a influência de uma chaperona em uma enzima específica pode ser determinada durante condições de stress, utilizando ensaios enzimáticos 14-16. Neste estudo, optou-se sobre-expressar HdeB em uma cepa rpoH exclusão, que não tem o fator sigma de choque térmico 32. rpoH controla a expressão de todos os principais E. chaperones coli e sua eliminação é conhecido por aumentar sensitivity a condições de stress ambientais que causam a proteína se desdobrar 15. A actividade in vivo de chaperona em HdeB foi determinada através da monitorização da sua capacidade para suprimir a sensibilidade da estirpe Δ rpoH pH. Ao todo, os protocolos aqui apresentados fornecem uma abordagem rápida e directa para caracterizar a actividade de uma chaperona activada por ácido in vitro, assim como no contexto in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A fim de estudar o mecanismo de activação e função de chaperona de HdeB, grandes quantidades de HdeB tem que ser expresso e purificado. Um número de sistemas de vector de expressão estão disponíveis para a produção de níveis elevados de uma proteína alvo, incluindo vectores pTrc ou pBAD, ambos os quais foram utilizados neste estudo. Os promotores sejam facilmente acessíveis para E. coli RNA polimerase e expressão, assim, permitir fortemente regulada positivamente de HdeB em qualquer E. c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Claudia Cremers para ela conselhos úteis sobre ensaios acompanhante. Ken Wan é reconhecido por sua assistência técnica na purificação HdeB. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Howard Hughes Medical (a JCAB) e os Institutos Nacionais de Saúde concessão RO1 GM102829 para JCAB e ujj-UD é apoiado por uma bolsa de pesquisa de pós-doutorado fornecido pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG).
Materials
| NEB10-beta E. coli cells | New England Biolabs | C3019I | |
| Ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-3 | |
| LB Broth mix, Lennox | LAB Express | 3003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Tris | Amresco | 0826-5kg | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Polymyxin B sulfate | ICN Biomedicals Inc. | 100565 | |
| 0.2 UM pore sterile Syringe Filter | Corning | 431218 | |
| HiTrap Q HP (CV 5 ml) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1153-01 | |
| Mini-Protean TGX, 15% | Bio-Rad | 4561046 | |
| Malate dehydrogenase (MDH) | Roche | 10127914001 | |
| Potassium phosphate (Monobasic) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| F-4500 fluorescence spectrophotometer | Hitachi | FL25 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126-5G | |
| NADH | Sigma | N8129-100MG | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9390-2.5KG | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S397-500 | |
| Lactate dehydrogenase (LDH) | Roche | 10127230001 | |
| Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392764 | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/ |
| Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled | Beckman Coulter | 306493 | |
| AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| Wizard Plus Miniprep Kit | Promega | A1470 | used for plasmid purification (Protocol 5.1) |
| L-arabinose | Gold Biotechnology | A-300-500 | |
| Glycine | DOT Scientific Inc | DSG36050-1000 | |
| Fluorescence Cell cuvette | Hellma Analytics | 119004F-10-40 | |
| Oligonucleotides | Invitrogen | ||
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP set | Invitrogen | 10297018 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL | Millipore | UFC900324 | |
| Centrifuge Avanti J-26XPI | Beckman Coulter | 393127 | |
| Varian Cary 50 spectrophotometer | Agilent Tech | ||
| Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa | Spectrum Laboratories | 132650 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K | Millipore | UFC803024 | |
| SDS | Fisher Scientific | bp166-500 | |
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher | 4375786 |
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