Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
Dieses Manuskript beschreibt die Einführung von Zell Führung Merkmale durch die direkte Lieferung von Zellen auf diese Funktionen in einem Hydrogel bioink unter Verwendung eines automatisierten Roboter-Abgabesystem verfolgt wird. Die besondere bioink ausgewählt wurde, wie es Zellen erlaubt, in Richtung zu sedimentieren und die Merkmale erfassen. Das Abgabesystem bioprints lebenden Zellen in Hydrogel bioinks einen Gegendruck unterstützt Druckkopf verwendet wird. Doch durch den Druckkopf mit einem geschärften Stift oder Skalpell ersetzt wurde, kann das Abgabesystem auch topographische Hinweise durch Anätzen zu erstellen verwendet werden. Der Taststift Bewegung kann in Schritten von 10 & mgr; m in der X, Y und Z-Richtung programmiert werden. Die gemusterte Nuten konnten mesenchymalen Stammzellen zu orientieren, beeinflussen sie eine längliche Morphologie in Ausrichtung mit den Nuten 'Richtung zu übernehmen. Die Strukturierung könnte entworfen werden unter Verwendung von Software zur grafischen Darstellung in geraden Linien, konzentrischen Kreisen und Sinuswellen. In einem nachfolgenden Verfahren, FibroBlasten und mesenchymalen Stammzellen wurden in einer 2% igen Gelatine bioink suspendiert, in einem Gegendruck angetrieben Extrusionsdruckkopf Bioprinting. Die Zellenlager bioink wurde dann gedruckt die gleichen programmierten Koordinaten für das Ätzen verwendet. Die bioprinted Zellen waren in der Lage zu den geätzten Merkmalen zu erfassen und darauf zu reagieren, wie durch ihre gedehnten Orientierung entlang der Richtung der geätzten Rillen gezeigt.
Introduction
Die gezielte Strukturierung von Zell Platzierung ermöglicht die Bildung von Kulturen , die 1 in vivo zellulären Organisation zu imitieren. Tatsächlich Erforschung der Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen können durch die Organisation ihrer räumlichen Anordnung 2,3- unterstützt. Die meisten Strukturierungssysteme beruhen auf Oberflächenmodifikation Verfahren zur Förderung oder Zelladhäsion mit anschließender passiver Zellaufbringeinrichtung zu verhindern. Bioprinting bietet räumliche und zeitliche Kontrolle über Zellverteilungen 1. Zusätzlich zu diesen Funktionen, Bioprinting wurde zur Erzeugung von geometrisch komplexen Gerüsten 4 als eine technisch einfache, schnelle und kostengünstige Methode beschrieben. Es nutzt Design – Software – Computer und ermöglicht die Einführung von Zellen in dem Herstellungsverfahren 4.
Bioprinting Systeme kategorisiert auf der Grundlage ihrer Arbeitsprinzipien als laserbasierte, Inkjet-basierten oder Extrusionsbasis 4. Extrusion Bioprinting wurde als der vielversprechendste beschrieben , da sie die Herstellung von Konstrukten organisiert klinisch relevanter Größen innerhalb eines realistischen Zeitrahmen 4-6 ermöglicht. Es wird entweder durch mechanische oder Gegendruck unterstützt Extrusion einer Zelle Lager Hydrogel bioink durchgeführt. In dem hier vorgestellten Verfahren wurde Gegendruck eingesetzt. Wie erwähnt, werden die Zellen in einem cytocompatible bioink geliefert. Eine solche bioink sollte die Lieferung von Zellen ohne Erzeugung schädlicher Scherspannung unterstützen, und sein einer ausreichenden Viskosität , die Integrität der gedruckten Bahn zu halten, ohne zu kollabieren oder Spreiz (bezeichnet als "Ausbluten") , 7-10.
Die Wechselwirkung von Zellen mit ihrer Haftfläche ist bekannt, Zellverhalten zu beeinflussen. Die Topographie Oberfläche kann steuern die Zellform, Orientierung 11 und auch den Phänotyp. Insbesondere haben die Herstellung von Nuten und Kanälen gezeigt, zu induziereneine gestreckte, längliche Morphologie auf mehreren Zelltypen. Die Annahme dieser Morphologie wurde mit dem Phänotyp von multi- und pluripotenten Zellen zu beeinflussen gefunden. Wenn zum Beispiel auf Rillen ausgerichtet sind , zeigen mesenchymalen Stammzellen (MSC) den Nachweis der Differenzierung zu Kardiomyozyten 12,13 und glatten Gefäßmuskelzellen übernehmen die Kontraktions Phänotyp über den synthetischen 10,14-17.
Die Zellkanäle oder Nuten ausrichten können über eine Anzahl von Verfahren auf einer Polymeroberfläche erzeugt werden, beispielsweise tiefes reaktives Ionenätzen, Elektronenstrahllithographie, Laserdirektdruck, Femtosekundenlaser, Photolithographie und Trockenätzen im Plasma 18. Diese Ansätze sind oft zeitaufwendig, erfordern eine komplexe Vorrichtung und kann in der Form des Musters erzeugt werden, zu begrenzen. Darüber hinaus synchronisiert sie nicht Musterung mit Bioprinting und nicht für den sofortigen Zellularisierung ermöglichen. Die koordinativ kontrollierte Bewegung eines automatisiertenAbgabesystem kann für die Abscheidung von Lösungen komplexer Muster folgen. Hier zeigen wir, wie die mikroskaligen gesteuerte Bewegung genutzt werden können Kanäle für die Zell Orientierung zu schaffen. Ein geschärfte Stift oder Skalpell wird an den Druckkopf anstelle der Extrusions Spritze befestigt und das Gerät kann dann die Polymeroberfläche unter der Anleitung der Software zur grafischen Darstellung ätzen. Das Verfahren bietet Vielseitigkeit in Musterentwurf und ist anwendbar auf polymere Materialien, die üblicherweise in Bioengineering verwendet, wie Polystyrol, PTFE, und Polycaprolacton. Als weiteren Schritt zum Ätzen können die Zellen auf die zerkratzte Nuten bioprinted direkt. Die Gelatine bioink hier verwendete konnte sowohl die Spur halten und die abgeschiedenen Zellen ermöglichen, die geätzten Strukturen zu erfassen. Mesenchymalen Stammzellen auf die geätzten Nuten bioprinted wurden an ihnen entlang in verschiedene Linien zu verlängern demonstriert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der entscheidende Schritt dieses Verfahrens ist die tatsächliche Bioprinting Lieferung der Stammzellen, da der Prozess zu den Merkmalen Zellsedimentation erlauben müssen, drucken, ohne bioink Verbreitung / Blutungen, liefern Zellen, ohne den Tod Schubspannung Zelle und nicht die Differenzierung gegenüber unerwünschten Linie auslösen.
Wenn die erwartete Zellenausrichtung ausbleibt, dann sollte die bioink Viskosität für ihre Eignung für den Druck beurteilt werden. Es ist wichtig, dass …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
Riferimenti
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