טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
כתב יד זה מתאר את המבוא של תכונות הדרכת תא ואחריו המסירה הישירה של תאים לתכונות הללו bioink הידרוג'ל באמצעות מערכת מחלק רובוטיות אוטומטית. Bioink בפרט נבחר כפי שהוא מאפשר לתאים משקעים כלפי ולחוש את התכונות. המערכת מהחלק bioprints תאי קיימא bioinks הידרוג'ל באמצעות ראש ההדפסה סייע backpressure. עם זאת, על ידי החלפת ראש ההדפסה עם עט או אזמל חדד, המערכת מהחלק יכולה גם להיות מועסקת על מנת ליצור רמזים טופוגרפיים דרך תחריט שטח. תנועת החרט ניתן לתכנת בצעדים של 10 מיקרומטר בכיווני X, Y ו- Z. החריצים בדוגמת הצליחו להתמצא בתאי גזע mesenchymal, תשפיע עליהם לאמץ מורפולוגיה מוארכת ובהלימה 'כיוון החריצים. הדפוסים יכולים להיות מתוכננים באמצעות תוכנת זומם בקווים ישרים, מעגלים קונצנטריים, וגלים סינוסי. בעוד הליך נוסף, פיברותקיעות ותאי גזע mesenchymal הושעו בתוך bioink ג'לטין 2%, עבור bioprinting ב ראש הדפסה שחול מונע backpressure. מסב תא bioink שהודפס מכן באמצעות אותן נקודות ציון מתוכנת המשמשות התחריט. תאי bioprinted הצליחו לחוש ולהגיב לתכונות החרוטות כפי שהוכח על ידי האורינטציה המוארכת שלהם יחד לכיוון החריצים החרוטים.
Introduction
הדפוסים המכוונים של מיקום תא מאפשרים ההיווצרות של תרבויות המחקים בארגון הסלולר vivo 1. ואכן, מחקר לתוך האינטראקציה בין סוגי תאים מרובים יכול להסתייע בארגון 2,3 המיקום המרחבי שלהם. רוב מערכות הדפוסים להסתמך על נהלי שינוי פני שטח לקידום או במניעת הידבקות תא עם בתצהיר תא פסיבי שלאחר מכן. Bioprinting מציע שליטה במרחב ובזמן על הפצות תא 1. בנוסף לפונקציות אלה, bioprinting תואר להיות שיטה פשוטה, מהירה טכנית וחסכונית להפקה 4 פיגומים גיאומטריים מורכבים. הוא מנצל תוכנות עיצוב במחשב ומאפשר כניסתה של תאים לתוך תהליך הייצור 4.
מערכות Bioprinting סווגו מבוססות על עקרונות העבודה שלהם כמו ליזר המבוסס, דיו מבוסס או שחול מבוסס 4. Bioprinting שחול תוארה המבטיח ביותר שכן היא מאפשרת הייצור של בונה מאורגנת בגדלים רלוונטיים קליני בתוך מסגרת זמן מציאותית 4-6. הדבר מתבצע באמצעות שחול סייע לחץ מכאני או אחורי של bioink הידרוג'ל תא נושא. בשיטה המוצגת כאן, חזרה לחץ הועסק. כאמור, התאים מועברים בתוך bioink cytocompatible. כזה bioink צריך לתמוך המשלוח של תאים מבלי לייצר מאמץ גזירה מזיק, ולהיות של צמיגות מספיק כדי לשמור על השלמות של הקורט המודפס, בלי להתמוטט או להפיץ (המכונה "לדמם דיו") 7-10.
האינטראקציה של תאים עם המשטח החסיד שלהם ידועה להשפיע על התנהגות הסלולר. טופוגרפית המשטח יכולה לשלוט על צורת התא, נטיית 11, ואפילו את הפנוטיפ. בפרט, הייצור של חריצים וערוצים הוכח לגרוםמורפולוגיה נמתחה, מוארכת על סוגי תאים מרובים. אימוץ מורפולוגיה זה כבר נמצא להשפיע על הפנוטיפ של תאי מולטיפוטנטיים ו פלוריפוטנטיים. לדוגמא, כאשר מיושרים על חריצים, בתאי גזע mesenchymal (MSC) מעיד בידול כלפי cardiomyocytes 12,13 ותאי שריר חלק בכלי דם לאמץ את הפנוטיפ ההתכווצות מעל הסינתטי 10,14-17.
התא יישור ערוצים או חריצים יכול להיווצר על משטח פולימרי באמצעות מספר שיטות, למשל, תחריט יון תגובתי עמוק, ליתוגרפיה אלומת אלקטרונים, הדפסת לייזר ישירה, לייזר femtosecond, photolithography ופלזמה יבש תחריט 18. גישות אלה הן בדרך כלל זמן רב, דורשות מנגנון מורכב ויכולות להיות הגבלה בצורת התבנית שנוצרה. בנוסף, הם לא לסנכרן דפוסים עם bioprinting ואינם מאפשרים עבור cellularization מיידית. התנועה נשלט בצורה מתואמת של אוטומטיותמערכת מחלק לעקוב אחרי תבניות מורכבות להפקדה של פתרונות. כאן אנו מדגימים כיצד תנועת microscale שבשליטת ניתן לנצל כדי ליצור ערוצים להתמצאות תא. עט או אזמל חדד מצורף ראש ההדפסה במקום של מזרק שהחול והציוד אז יכול לחרוט את פני שטח הפולימר תחת הדרכתו של התוכנה והתוויית. השיטה מציעה צדדית דפוס עיצוב שלכם והיא חלה על חומרים פולימריים נפוצים Bioengineering כגון פוליסטירן, PTFE, ו polycaprolactone. כצעד לאחר התחריט, תאים ניתן bioprinted ישירות החריצים השרוטים. Bioink ג'לטין מנוצל כאן הצליח הוא לשמור על השמץ ולאפשר לתאים שהופקדו לחוש את התכונות החרוטות. תאי גזע mesenchymal bioprinted לחריצי חרוט הודגמו להאריך לאורך אותם קווים ברורים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב הקריטי של הליך זה הוא משלוח bioprinting בפועל של תאי הגזע כתהליך חייב לאפשר שקיעת תא לתכונות, להדפיס ללא bioink מתפשטת / דימום, לספק תאים בלי מוות של תאי מאמץ גזירה ולא לעורר בידול כלפי שושלת רצויה.
אם יישור התא הצפוי נכשל אמורה להתרחש,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
Riferimenti
- Ma, Z., Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P., et al. . Cell and Organ Printing. , 137-159 (2010).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 123-152 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Skardal, A., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 1-17 (2015).
- Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16 (2015).
- Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
- Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
- Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
- Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
- Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
- Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
- Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089 (2014).
- Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
- Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
- Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
- Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
- Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Merceron, T. K., Murphy, S. V., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 249-270 (2015).
- Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K., Yoo, J. J. . Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 229-248 (2015).
- Lee, K. V., Turksen, K., et al. . Bioprinting in Regenerative Medicine. , 33-66 (2015).
- Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
- Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
- Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041 (2014).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
- Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109 (2014).
- Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105 (2014).
- Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels – The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).
