Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, हम एन के एपिडर्मिस में stromule आवृत्ति परख करने की क्रिया पर ध्यान केंद्रित किया है benthamiana छोड़ देता है। कई स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न किया गया है कि इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 35S प्रो सहित: FNRtp: EGFP 13 और NRIP1: आसमानी 6। इन लाइनों के दोनों स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के अधीन हो क्लोरोप्लास्ट पत्तियों का स्ट्रोमा में fluorophores की मजबूत अभिव्यक्ति दिखा। वैकल्पिक रूप से, क्लोरोप्लास्ट-लक्षित fluorophores क्षणिक एन में व्यक्त किया जा सकता है benthamiana एग्रोबैक्टीरियम का उपयोग कर 13 परिवर्तनों। यह ट्रांसजेनिक लाइनों से कम आदर्श है के बाद से एग्रोबैक्टीरियम घुसपैठ एन में कुछ बेसल रक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित benthamiana और Agrobacterium के साथ बातचीत पत्ती 14 में stromule आवृत्ति को बदल सकते हैं, संभावित परिणामों की व्याख्या उलझी। अंत में, इन विट्रो में stromule गठन कल्पना करने के लिए,अनुभाग नीचे 5 में वर्णित के रूप में क्लोरोप्लास्ट, किसी भी पौधों की प्रजातियों से निकाला जा सकता है, या तो आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorophores या एक फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग। 9,15
नोट:। पौधों की खेती के लिए विस्तृत तरीकों पहले वर्णित किया गया है 16 संक्षेप में, एन बढ़ने 4 "किसी भी व्यावसायिक मिट्टी के मिश्रण को अच्छी जल निकासी प्रदान करता है के साथ भरा बर्तन में benthamiana पौधों। पहले 10-14 दिनों के अंकुरण के लिए एक नम वातावरण प्रदान करने के लिए एक स्पष्ट प्लास्टिक गुंबद के साथ पौध को कवर किया। 14- करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन किसी भी मानक उर्वरक मिश्रण जोड़ें दिन पुरानी पौधों। नियमित रूप से सफेद रोशनी के तहत पौधों को विकसित, का उपयोग कर ~ 100 μmol फोटॉनों एम -2 सेकंड -1 प्रकाश की तीव्रता। पानी के पौधों।
दृश्य के लिए 1. तैयारी पत्ता नमूने
नोट: Stromule गतिशीलता, 8 लोग घायल हो गए से प्रभावित कर रहे हैं ताकि ऊतक तैयारी stromule visualizing से ठीक पहले आयोजित किया जाना चाहिएconfocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा एस। आदर्श रूप में, एक नमूना संयंत्र से हटाने के बाद 15 मिनट के साथ कल्पना की जानी चाहिए।
- पत्ती एक बहुत तेज धार का उपयोग करने का एक छोटा सा वर्ग कट। हमेशा स्थिरता के लिए पत्ती के एक ही क्षेत्र का उपयोग करें, और एक ही सतह (adaxial या abaxial) सभी प्रयोगों में कल्पना करने के लिए कुछ खास होगा।
- इसके तत्काल बाद पत्ती अनुभाग काटने के बाद एक 5 मिलीलीटर needleless पानी से भर सिरिंज में पत्ती अनुभाग डूब, सिरिंज से हवा निकालने के लिए, और एक उंगली से सिरिंज छिद्र को कवर करने और सवार खींच कर एक निर्वात लागू होते हैं।
- सवार धीरे रिलीज पत्ती अनुभाग को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए। यह दो या तीन बार दोहराएँ, या जब तक हवा के सबसे हटा दिया गया है और पत्ती गहरे हरे रंग की प्रतीत होता है।
नोट: यह कदम पत्ती कि stromules की सटीक दृश्य के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं में हवा को हटा।
- सवार धीरे रिलीज पत्ती अनुभाग को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए। यह दो या तीन बार दोहराएँ, या जब तक हवा के सबसे हटा दिया गया है और पत्ती गहरे हरे रंग की प्रतीत होता है।
- पानी की एक बूंद एक स्लाइड में जोड़े और इस गिरावट पर पत्ती अनुभाग जगह है। फिर, एक और डॉ जोड़नेपत्ती के शीर्ष करने के लिए पानी की सेशन, और पत्ती पर एक कवर पर्ची जगह है। किसी भी हवाई बुलबुले हैं, तो धीरे कवर पर्ची जब तक वे निकाल रहे हैं नल। स्लाइड अब माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार है, और तुरंत कल्पना की जानी चाहिए।
2. confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ Visualizing Stromules
- प्रेषित प्रकाश के साथ, पत्ती अनुभाग के केंद्र (कोशिकाओं धार से क्षतिग्रस्त से दूर) के पास देखने का एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित। एक 20x उद्देश्य तो यह है कि कई क्लोरोप्लास्ट एक साथ देखे जा सकते हैं का प्रयोग करें। प्रेषित प्रकाश के साथ एक छवि को बचाने के लिए इतना है कि सेल प्रकार, बाद में प्रतिष्ठित किया जा सकता यदि आवश्यक है।
- के लिए इस्तेमाल किया जा रहा fluorophore उचित उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक लेजर को रोशनी स्रोत स्विच। उदाहरण के लिए, एक 488 एनएम लेजर के साथ GFP उत्तेजित और 500 एनएम और 525 एनएम के बीच उत्सर्जन इकट्ठा।
- माइक्रोस्कोप के सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, GFP चैनल चुनें और पिनहोल एपर्चर के लिए 1 ऐ समायोजित करने के लिए क्लिक करेंRY इकाई। , लेजर स्कैनिंग का चयन नमूना visualizing शुरू करने के लिए, और फिर GFP चैनल क्लिक लेजर तीव्रता और जबकि अभी भी स्पष्ट रूप से stromules visualizing लेजर शक्ति को कम करने के लिए डिटेक्टर लाभ को समायोजित करने के लिए। एक बार इन सेटिंग्स निर्धारित किया गया है, उन्हें यथासंभव अनुरूप सभी प्रयोगों भर में रखने के लिए।
- एक Z -stack प्रयोग है कि देखने के क्षेत्र में पत्ती एपिडर्मिस के माध्यम से छवियों की एक श्रृंखला इकट्ठा करेंगे तैयार करें।
- जेड -stack के लिए, (उदाहरण के लिए, यदि पत्ती की सतह के पास क्लोरोप्लास्ट का परीक्षण शर्तों के तहत और अधिक stromules है) पूर्वाग्रह से बचने के लिए देखने के क्षेत्र में सभी एपिडर्मल क्लोरोप्लास्ट शामिल हैं।
- अधिकतम अंतराल संभव पर छवियों है कि सभी stromules समय एक Z -stack के लिए आवश्यक शामिल होंगे, लेकिन कम से कम रखना। उदाहरण के लिए, अगर 1 हवादार इकाई, एक में फोकस confocal खंड है कि 2 माइक्रोन गहरी के बराबर है एक छवि ले रही हर 2 माइक्रोन संभावना आदर्श है।
नोट: पत्ती epidermiएक असमान सतह, तो Z -stack नमूना के आधार पर अलग अलग होंगे की कुल गहराई है; सबसे Z -stacks 10-20 छवियों की आवश्यकता होगी, लेकिन अधिक शामिल हो सकते हैं। - (आम तौर पर 5-10 मिनट के भीतर यदि संभव हो तो) यकीन है कि जेड -stack जल्दी से एकत्र किया जाता है बनाने के लिए स्कैनिंग की गति और छवि संकल्प के रूप में आवश्यक समायोजित करें। बाद में विश्लेषण के लिए z -stack बचाओ।
3. इमेज प्रोसेसिंग
- stromule आवृत्ति किसी भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग निर्धारित करते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, हम ImageJ है, जो स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (http://imagej.nih.gov/ij/), या ImageJ, फिजी के लोकप्रिय उन्नयन से सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है (http://fiji.sc का उपयोग करना चाहिये /फ़िजी)।
- सॉफ्टवेयर में अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग कर एक ही छवि में Z -stack मिलाएं।
- पहचानें और मैन्युअल छवि में सभी क्लोरोप्लास्ट गिनती।
- प्रत्येक क्लोरोप्लास्ट के लिए, नेत्रहीन कि एक या अधिक stromules निर्धारितविलय Z -stack छवि में क्लोरोप्लास्ट से देने में देखा जाता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 1 देखें।
नोट: चूंकि stromules की जैविक कार्यों में जाना जाता है नहीं कर रहे हैं, किसी भी पतली, स्ट्रोमा-भरा, ट्यूबलर क्लोरोप्लास्ट से विस्तार एक "stromule", लंबाई की परवाह किए बिना माना जा सकता है। अगर यह लगभग 1 माइक्रोन इसकी लंबाई 7 के अधिकांश के साथ व्यास की तुलना में कम है एक सामान्य नियम के रूप में, क्लोरोप्लास्ट से एक स्ट्रोमा से भरे विस्तार एक stromule है। सुनिश्चित करें कि एक व्यक्ति का निर्धारण किया जाए या नहीं एक क्लोरोप्लास्ट एक stromule है व्यक्तिपरक में मतभेद के लिए नियंत्रित करने के लिए सभी छवियों का विश्लेषण करती है। एक दूसरा शोधकर्ता स्वतंत्र रूप से stromule आवृत्तियों को सत्यापित आगे व्यक्तिपरक पूर्वाग्रहों को कम करने के लिए करना चाहिए।
4. प्रयोगात्मक डिजाइन और नमूना
नोट: Stromule आवृत्ति पत्तियों के बीच अत्यधिक चर रहा है, लेकिन कई रिपोर्टों का सुझाव एक व्यक्तिगत भीतर stromule आवृत्ति में थोड़ा बदलाव है कि वहाँदोहरी पत्ती 9,17।
- एक पत्ती के दृश्य के एक ही क्षेत्र से पत्ता stromule आवृत्ति की गणना। पत्ती त्यागें, और यह एक स्वतंत्र नमूना पर विचार करें। स्वतंत्र नमूने के रूप में एक पत्ती से देखने का अलग अलग क्षेत्रों पर विचार नहीं है।
नोट: वहाँ कैसे करने के लिए सबसे अच्छा उपाय परिवर्तन stromule गतिविधि में, और जब तक stromules के समारोह में अधिक स्पष्ट रूप से परिभाषित किया गया है, शोधकर्ताओं stromule गतिशीलता बढ़ाता में रचनात्मक होना करने के लिए जारी रखना चाहिए पर कोई मजबूत आम सहमति है। साहित्य भर में तुलना के लिए, हालांकि, रिपोर्टिंग की आम मानकों और अधिक रचनात्मक दृष्टिकोण के लिए इसके अलावा में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। कम से कम, हमेशा क्लोरोप्लास्ट एक या एक से अधिक stromules है की आवृत्ति की रिपोर्ट। - क्लोरोप्लास्ट है कि देखने के एक क्षेत्र में stromules की आवृत्ति निर्धारित करते हैं। ImageJ प्रयोग को देखने के एक क्षेत्र में सभी क्लोरोप्लास्ट की पहचान। फिर, प्रत्येक क्लोरोप्लास्ट के लिए, निर्धारित क्लोरोप्लास्ट कम से कम एक stromule का गठन किया है। percenta के रूप में रिपोर्ट stromule आवृत्तिएक stromule साथ क्लोरोप्लास्ट की जीई।
नोट: कुछ शोधकर्ताओं का प्रतिशत, arcsine परिवर्तन के साथ उदाहरण के लिए, को बदलने stromule आवृत्तियों रिपोर्ट करने के पहले; जबकि इस सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक विकल्प है, stromule आवृत्ति की arcsine एक सहज ज्ञान युक्त मूल्य नहीं है, और मुख्य पाठ या एक अध्ययन के आंकड़ों में सूचित किया जाना करने की जरूरत नहीं है।- एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, stromules की कुल संख्या गिनती, और क्लोरोप्लास्ट की कुल संख्या से विभाजित।
नोट: सबसे परिस्थितियों में, इस 4.2 दृष्टिकोण करने के लिए इसी तरह के परिणाम निकलेगा; यह stromule आवृत्ति overestimate सकता है, हालांकि, अगर एक भी क्लोरोप्लास्ट कई stromules का गठन किया है। उदाहरण के प्रतिनिधि परिणामों के तहत दिखाया गया है, उदाहरण के लिए, कई क्लोरोप्लास्ट दो या अधिक stromules 40/87 को क्लोरोप्लास्ट प्रति stromules की संख्या (बनाम 33/87 की एक stromule आवृत्ति) जुटाने की है। - वैकल्पिक रूप से, stromule आवृत्ति के बजाय stromule लंबाई निर्धारित। लंबाई मापी जा सकती हैमुक्तहस्त लाइन उपकरण के साथ stromule अनुरेखण द्वारा ImageJ में।
नोट: चूंकि stromules की जैविक भूमिका अनजान बनी हुई है, यह है कि stromule लंबाई उनके कार्य को प्रभावित करता है स्पष्ट नहीं है। stromule लंबाई अगर वे मनाया जाता है में महत्वपूर्ण मतभेद की रिपोर्ट, लेकिन यह भी stromule आवृत्तियों (4.2 में वर्णित के रूप में) की रिपोर्ट।
नोट: Stromule आवृत्ति ही विकास शर्तों के तहत अलग-अलग पत्तियों के बीच अत्यधिक चर हो सकता है। इसलिए, हालांकि stromule आवृत्ति को निर्धारित समय लेने वाली हो सकती है, प्रयोगों को ध्यान से बड़ा नमूना आकार में शामिल करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए। हमारी प्रयोगशाला से डेटासेट का उपयोग करना, हम निर्धारित किया है कि प्रत्येक उपचार के लिए कम से कम 16 पौधों का एक नमूना आकार अगर वहाँ कम से कम दो स्थितियों के बीच stromule आवृत्ति में 1.5 गुना परिवर्तन का एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर है निर्धारित करने के लिए आमतौर पर पर्याप्त शक्तिशाली है (मानक के साथ α = 0.05 और β = 0.80)।
- एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, stromules की कुल संख्या गिनती, और क्लोरोप्लास्ट की कुल संख्या से विभाजित।
- परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण।
- मेरे तुलना करने के लिएदो उपचार की एक stromule आवृत्तियों, वेल्च की टी परीक्षण (भी heteroscedastic टी परीक्षण या टी परीक्षण असमान विचरण संभालने के रूप में जाना जाता है) का उपयोग करें।
नोट: इस परीक्षा में पारंपरिक छात्र टी परीक्षण के रूप में शक्तिशाली नहीं है, लेकिन वेल्च की टी परीक्षण फायदेमंद है क्योंकि यह नहीं मानता कि stromule आवृत्ति वितरण में विचरण उपचार के बीच इसी तरह की है।
नोट: चूंकि stromule आवृत्ति एक "अनुपात" है, इसका नमूना वितरण, द्विपद बजाय सामान्य रहने की भविष्यवाणी की है जो कर सकता है सैद्धांतिक रूप से तिरछा सांख्यिकीय विश्लेषण करता है, तो नमूना आकार बहुत कम हैं या stromule आवृत्ति (0% के करीब) या बहुत बहुत कम है, तो उच्च (100% के करीब)। कुछ रिपोर्टों के सांख्यिकीय विश्लेषण है, जो एक सामान्य वितरण के लिए एक द्विपद वितरण को बदलने, और इस तरह एक छात्र के टी परीक्षण या एनोवा के मानक आवश्यकताओं को पूरा करने का इरादा है पहले arcsine परिवर्तनों का इस्तेमाल किया है। व्यवहार में, हालांकि, एकrcsine परिवर्तनों सांख्यिकीय विश्लेषण पर बहुत कम या कोई प्रभाव नहीं है, और इसलिए की सिफारिश नहीं कर रहे हैं। इसके बजाय, नमूने का आकार है, जो सांख्यिकीय शक्ति बढ़ाने के लिए और डेटा की व्याख्या में त्रुटियों को कम करेगा बढ़ाने के लिए प्रयोगों को दोहराएँ। - जो भी हो सांख्यिकीय दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया जाता है, ध्यान से नमूना रणनीति, नमूना आकार, सांख्यिकीय परीक्षण, और पी मूल्य एक प्रयोग के लिए रिपोर्ट करने के लिए सुनिश्चित हो।
ध्यान दें: जीव विज्ञान के अन्य क्षेत्रों के साथ के रूप में, एक पी मूल्य कम से कम 0.05 पर विचार किया जा सकता है "सांख्यिकीय महत्वपूर्ण" है, हालांकि शोधकर्ताओं ने निश्चित रूप से प्राप्त सटीक पी मूल्य रिपोर्ट करना चाहिए। अगर पी थोड़ा 0.05 से ऊपर है, दो या तीन प्रयोगों के साथ नमूना आकार में वृद्धि को स्पष्ट करने के लिए किया जाए या नहीं फर्क मनाया प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है मदद मिल सकती है।
- मेरे तुलना करने के लिएदो उपचार की एक stromule आवृत्तियों, वेल्च की टी परीक्षण (भी heteroscedastic टी परीक्षण या टी परीक्षण असमान विचरण संभालने के रूप में जाना जाता है) का उपयोग करें।
5. Stromule गतिशीलता कल्पना को बरकरार क्लोरोप्लास्ट निकालने
नोट: कई तरीकोंपत्तियों से क्लोरोप्लास्ट अलग करने के लिए इन विट्रो 15 में stromule गठन पर हाल के एक अध्ययन में एक से थोड़ा अलग प्रोटोकॉल सहित इस्तेमाल किया गया है। प्रोटोकॉल नीचे विस्तृत एक अपेक्षाकृत सरल तरीका है कि biochemically शुद्ध क्लोरोप्लास्ट नमूने उपज नहीं है का उपयोग करता है, लेकिन इसके बजाय बरकरार, स्वस्थ क्लोरोप्लास्ट 9,18 की एक बड़ी मात्रा को अलग करता है।
- ठंड निष्कर्षण बफर तैयार: 50 मिमी Hepes NaOH, 330 मिमी sorbitol, 2 मिमी EDTA, 1.0 मिमी 2 MgCl, और 1.0 मिमी MnCl 2। NaOH और एचसीएल, और उपयोग करने से पहले शीतल के साथ 6.9 पीएच को समायोजित करें।
नोट: हालांकि जरूरी नहीं, ठंड buffers का उपयोग और बर्फ पर नमूने रखते हुए संभव है जब बरकरार क्लोरोप्लास्ट की एक उच्च अनुपात निकलेगा। - अलगाव बफर तैयार: 50 मिमी Hepes NaOH, 330 मिमी sorbitol, 2 मिमी EDTA, 1.0 मिमी MnCl 2, 1.0 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी KCl, और 1.0 मिमी NaCl। NaOH और एचसीएल और उपयोग करने से पहले शीतल के साथ 7.6 पीएच को समायोजित करें।
- पत्ते नहीं हैंडाइमिथाइल sulfoxide में 50 मिमी CFDA शेयर समाधान (DMSO) (1.0 मिलीलीटर DMSO प्रति 2.3 मिलीग्राम CFDA): एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग stromal fluorophore व्यक्त Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) समाधान तैयार है।
नोट: सटीक एकाग्रता महत्वपूर्ण नहीं है। हर समय अंधेरे में CFDA शेयर रखें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिमी CFDA के छोटे aliquots स्टोर। - क्लोरोप्लास्ट को अलग-थलग करने के लिए, कई पौधों से ~ 5-10 जी पत्तियों को हटा दें और कुछ समय के लिए ठंडे पानी में कुल्ला। इसके तत्काल बाद 50 मिलीलीटर ठंड निष्कर्षण बफर के लिए स्थानांतरण। पीस पत्ते कई लघु दालों के साथ एक ब्लेंडर का उपयोग कर। जाली के दो या तीन परतों के माध्यम से फिल्टर पत्ती मलबे को हटाने के लिए, दो 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में निकाले क्लोरोप्लास्ट विभाजित है, और 750 x जी 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10 मिलीलीटर अलगाव बफर में हरी क्लोरोप्लास्ट resuspend। अपकेंद्रित्र फिर 750 XG पर 1 मिनट के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और अलगाव बफर में resuspend क्लोरोप्लास्ट 5 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए।
- स्थानांतरण 201, एक स्लाइड के लिए क्लोरोप्लास्ट के एल, एक coverslip के साथ कवर, और माइक्रोस्कोपी शुरू करते हैं।
नोट: प्लास्टाइड-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक पौधों से क्लोरोप्लास्ट अब confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा दृश्य के लिए तैयार हैं। - कि प्लास्टाइड-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त नहीं कर रहे हैं stromules कल्पना करने के लिए पौधों से क्लोरोप्लास्ट दाग।
- 5 मिलीलीटर अलगाव बफर में क्लोरोप्लास्ट से निलंबित करने के लिए 50 मिमी CFDA शेयर के 5 μl जोड़ें। 50 माइक्रोन के लिए अंतिम एकाग्रता लाने के लिए।
- क्लोरोप्लास्ट 5 मिनट के लिए सेते हैं, और फिर एक स्लाइड के लिए एक छोटे से विभाज्य (~ 50 μl) हस्तांतरण, एक coverslip के साथ कवर, और माइक्रोस्कोपी शुरू करने की अनुमति दें।
- एक FITC या GFP फिल्टर सेट का प्रयोग करें। एक अलग क्लोरोप्लास्ट कल्पना करने के लिए एक साथ कई क्लोरोप्लास्ट कल्पना करने के लिए एक 20x उद्देश्य, या एक उच्च उद्देश्य का उपयोग करें।
नोट: CFDA बरकरार क्लोरोप्लास्ट की स्ट्रोमा अंदर प्रतिदीप्ति जाएगा। - अगर कोई मजबूत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति है, Chlo धोनेCFDA, 750 XG पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज के साथ 5 मिनट ऊष्मायन के बाद 10 मिलीलीटर अलगाव बफर में फिर से roplasts, तैरनेवाला, और 5 मिलीलीटर अलगाव बफर में resuspend त्यागें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल युवा एन के बीजपत्र में दिन में और रात में stromule आवृत्ति कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था benthamiana पौध। एक z- ढेर से स्लाइस एक एकल छवि (चित्रा 1 ए) में विलय कर दिया गया था। दृश्य प्रयोजनों के लिए, कि छवि तो desaturated और उल्टे इतना है कि स्ट्रोमा प्रतीत होता है काला (चित्रा 1 बी) था। क्लोरोप्लास्ट या तो कोई stromules (हरी तारांकन) कर रहे हैं या कम से कम एक stromule (मैजेंटा तारांकन) होने के रूप में चिह्नित किया गया था। 87 एपिडर्मल कल्पना की क्लोरोप्लास्ट से 33 stromules है। इस प्रकार, इस पत्ती में stromule आवृत्ति 37.9% है।
इस विश्लेषण का प्रयोग, प्रोटोकॉल एक और 21 पौधों (संयंत्र प्रति एक पत्ती) दिन और रात में 24 संयंत्रों की कुल दौरान के लिए दोहराया गया था। दिन में, औसत stromule आवृत्ति 20.8 ± 1.8% थी; रात में, औसत stromule आवृत्ति था 12.8 ± 0.9% (चित्रा2)। Stromule आवृत्ति के रूप में वेल्च की टी परीक्षण द्वारा निर्धारित दिन के दौरान काफी अधिक था (एन ≥ 22, पी <0.0005)। ध्यान दें कि हालांकि 23,000 से अधिक क्लोरोप्लास्ट और कई सौ कोशिकाओं मनाया गया, नमूना आकार, एन, 22 के रूप में सूचना दी है, स्वतंत्र पौधों की संख्या की जांच की।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, क्लोरोप्लास्ट stromules एन की पत्तियों से अलगाव के बाद इन विट्रो में मनाया गया benthamiana प्लास्टाइड-लक्षित GFP (चित्रा 3) को व्यक्त करने के लिए, या एन से अलग क्लोरोप्लास्ट दाग CFDA उपयोग करने के बाद benthamiana (चित्रा 3 बी) या Spinacia गोभी (चित्रा 3 सी)।
चित्रा 1 एन में stromule आवृत्ति बढ़ाता Benthamiana पत्तियों। (ए) एक जेड -stack एन की एपिडर्मिस के दृश्य के एक आंशिक क्षेत्र से benthamiana व्यक्त stromal GFP एक ही छवि में सभी एपिडर्मल क्लोरोप्लास्ट और stromules दिखाने के लिए विलय कर दिया गया था। (बी) इस छवि को काले और सफेद करने के लिए परिवर्तित और दृश्य प्रयोजनों के लिए उलटा था। stromules साथ क्लोरोप्लास्ट एक मैजेंटा तारांकन द्वारा संकेत कर रहे हैं; stromules बिना क्लोरोप्लास्ट एक हरे रंग की तारांकन के संकेत हैं। स्केल सलाखों 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। Brunkard एट अल से संशोधित। 9 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. शर्तों भर stromule आवृत्ति की तुलना। इस प्रोटोकॉल एसटीआर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया थादिन में 22 पौधों और रात में 24 संयंत्रों में Omule आवृत्ति। Stromule आवृत्ति रात में की तुलना में दिन के दौरान काफी अधिक था (वेल्च की टी परीक्षण, एन ≥ 22, पी <0.0005)। त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि संकेत मिलता है। Brunkard एट अल से संशोधित। 9 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. पत्तियों से बरकरार क्लोरोप्लास्ट निकालने के बाद stromules Visualizing। (ए) ट्रांसजेनिक एन से क्लोरोप्लास्ट benthamiana व्यक्त GFP (हरा) क्लोरोप्लास्ट प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित का उपयोग कर अलग कर रहे थे करने के लिए लक्षित छोड़ देता है। (बी) के क्लोरोप्लास्ट प्रकार के जंगली एन से अलग थे benthamiana पत्तियों और CFDA, जो Fluo के साथ दागकेवल बरकरार है, व्यवहार्य क्लोरोप्लास्ट के अंदर resces (पीले रंग में दिखाया गया है)। (सी) क्लोरोप्लास्ट भी इस तरह के पालक के रूप में अन्य प्रजातियों के पौधे, से अलग किया जा सकता है (एस गोभी), और फिर CFDA (पीला) के साथ दाग। क्लोरोफिल autofluorescence लाल रंग में दिखाया गया है। Brunkard एट अल से संशोधित। 9
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Discussion
जब stromules की जांच, तीन महत्वपूर्ण कारकों के दौरान विचार किया जाना चाहिए: (i) संयंत्र के ऊतकों को एक निरपेक्ष न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए के हेरफेर, (ii) प्रायोगिक प्रणाली के अनुरूप रखा जाना चाहिए, और (iii) नमूना रणनीति सावधानी से करने के लिए योजना बनाई जानी चाहिए मजबूत सुनिश्चित करने, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा विश्लेषण कर रहे हैं।
Stromules उल्लेखनीय गतिशील हैं: वे का विस्तार करने और माइक्रोस्कोप के तहत एक पर्यवेक्षक की आंखों के सामने तेजी से वापस लेना कर सकते हैं। इसके अलावा, stromule आवृत्ति उपचार की एक विस्तृत श्रृंखला है, उत्तेजनाओं कि आदेश में (जैसे पत्ती लोग घायल हो गए के रूप में) stromules कल्पना करने में टाला नहीं जा सकता है सहित के जवाब में काफी भिन्न होता है। इस समस्या है, जो यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के साथ संबोधित किया है करने के लिए प्राथमिक समाधान है, अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोगों का संचालन करने के लिए, सभी चर अनुरूप रखे हुए है। इस उदाहरण के लिए, शामिल है, तुरंत इसे माइक्रोस्कोप को लाने से पहले दृश्य के लिए प्रत्येक नमूना तैयारी; पौधों क्षतिग्रस्त नहीं किया जाना चाहिएतुरंत जब तक दृश्य से पहले। पत्ती को हटाने या किसी भी नुकसान के कारण के बिना आदर्श रूप में, किसी भी उपचार संयंत्र के लिए सीधे लागू किया जाना चाहिए: इस समस्या का समाधान दूसरे प्रोटोकॉल की जटिलता को कम करने के लिए है।
Stromules प्रजातियों और गेहूं जड़ बाल, टमाटर फल, और etiolated तंबाकू पौध 8,19 सहित सेल प्रकार की एक बुलंद सरणी में अध्ययन किया गया है। ये अग्रणी अध्ययन के संयंत्र के विकास के दौरान stromule गतिशीलता की समझ उन्नत और stromule गतिविधि की सीमा का पता लगाया। इन विभिन्न प्रायोगिक प्रणाली से तुलना आकर्षित करते है, तथापि, गलत व्याख्याओं को जन्म दे सकता है, क्योंकि प्लास्टिडों के विभिन्न प्रकार के काफी अलग जैविक प्रक्रियाओं में शामिल रहे हैं।
उदाहरण के लिए, क्लोरोप्लास्ट संश्लेषक इलेक्ट्रॉन श्रृंखला की वजह से ऑक्सीडेटिव तनाव के जवाब में stromules बना है, लेकिन जब से leucoplasts संश्लेषक मशीनरी की कमी है, वे के प्रति संवेदनशील नहीं हैंएक ही उत्तेजनाओं 9। किसी भी प्रयोगात्मक प्रणाली stromules जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन प्रायोगिक प्रणाली अध्ययन भर में लगातार रखा जाना चाहिए कि अगर किसी भी तुलना के लिए तैयार हो रहे हैं। कारकों पर विचार करने के लिए प्रजातियों, सेल प्रकार, विकास मंच या संयंत्र की उम्र, और (स्थिर transgene अभिव्यक्ति, क्षणिक transgene अभिव्यक्ति, या एक बाहरी fluorophore माध्यम से) धुंधला stromules की विधि शामिल हैं; इन कारकों में से भी मामूली बदलाव के परिणाम के बाद में व्याख्या उलझाना कर सकते हैं।
अंत में, stromule जीव विज्ञान के किसी भी अध्ययन सुनिश्चित करने के लिए है कि परिणाम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और जैविक रूप से प्रासंगिक हैं एक मजबूत, विश्वसनीय नमूना रणनीति का उपयोग करना चाहिए। सैम्पलिंग को बार-बार एक ही पौधे, जैसे, एक पत्ती के कई क्षेत्रों से छवियों को लेने से, जाहिरा तौर पर सांख्यिकीय शक्ति में सुधार होगा, लेकिन भ्रामक हो सकते हैं। जैसा कि ऊपर प्रतिनिधि डेटा में दिखाया गया है, एक भी पत्ती के stromule आवृत्ति मतलब stromule आवृत्ति से नाटकीय रूप से भिन्न हो सकते हैंकई पत्ते के पार: यह है कि पत्ती, जो दिन के दौरान कल्पना की गई थी में, क्लोरोप्लास्ट की 37.9% stromules, बनाया है, हालांकि दिन के दौरान पत्ते भर मतलब stromule आवृत्ति लगभग आधा है कि, केवल 20.8% थी।
इसके अलावा, यह देखते हुए कि कैसे छोटे से इस समय stromule गतिशीलता के बारे में जाना जाता है, किसी भी प्रयोग पूरी तरह से कम से कम तीन बार दोहराया जाना चाहिए, और यदि संभव हो तो अधिक है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि अप्रत्याशित चर stromule गतिविधि में कोई परिवर्तन है कि मनाया जाता है के लिए जिम्मेदार नहीं हैं। और सब से ऊपर है, क्योंकि stromule जीव विज्ञान के क्षेत्र में सिर्फ बंद लेने के लिए शुरुआत है, शोधकर्ताओं ने ध्यान से दस्तावेज़ और यहाँ उल्लिखित सरल प्रोटोकॉल से रचनात्मक विचलन सहित प्रयोगात्मक डिजाइन के सभी पहलुओं की रिपोर्ट है, करना चाहिए।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| NaOH | Fischer-Scientific | S320-1 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| EDTA | Fischer-Biotech | BP121 | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss Inc | Model: LSM710 | |
| Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) | Sigma-Aldrich | 21879 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | EMD | MX1458-6 | |
| Waring blender | Waring | Model: 31BL92 | |
| Fiji | fiji.sc | Open-source software for analyzing biological images |
References
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