Het gebruik van een filter cartridge voor filtratie van watermonsters en Winning van Environmental DNA
Summary
We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Abstract
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Introduction
Environmental DNA (eDNA) in het aquatisch milieu verwijst naar genetisch materiaal gevonden in de waterkolom. Recente studies toonden het nut van eDNA voor het detecteren van vissen uit verschillende aquatische milieus, zoals vijvers 1-3, 4-8 rivieren, beken 9 en zeewater 10-14. De meeste van deze studies gericht op de detectie van een enkele of een paar invasieve 1,4-6,8,14 en zeldzame of bedreigde diersoorten 3,9, terwijl sommige recente studies geprobeerd simultane detectie van meerdere soorten in lokale vis gemeenschappen 7,9, 12,13,15 en mesokosmossen 11,12.
De laatste benadering wordt genoemd "metabarcoding" en eDNA metabarcoding maakt gebruik van één of meerdere sets van PCR-primers aan een gen regio coamplify over taxonomisch diverse monsters. Daarna volgt bibliotheek preparaat met indexering en toevoeging adapter en de geïndexeerde bibliotheken geanalyseerd door high-throughput parallel sequencingplatform. Onlangs Miya et al. 12 ontwikkelde universele PCR primers voor metabarcoding eDNA van vissen (genaamd "MiFish"). De MiFish primers richten op een hypervariabel gebied van het mitochondriale 12S rRNA-gen (163-185 bp), die voldoende informatie bevat om vissen te identificeren taxonomische familie, geslacht en soort met uitzondering van enkele nauw verwante soortgenoten. Met het gebruik van deze primers in eDNA metabarcoding, Miya et al. 12 ontdekt meer dan 230 subtropische mariene soorten van aquarium tanks met bekende soortensamenstelling en koraalriffen in de buurt van het aquarium.
Terwijl het optimaliseren van de metabarcoding protocol natuurlijk zeewater tegemoet met verschillende niveaus van eDNA concentratie van vissen, hebben we gemerkt dat de MiFish primers af en toe niet in geslaagd om het doelgebied voor de latere uitwerking bibliotheek te versterken. Een van de meest voorkomende reden hiervoor mislukte PCR amplificatie gebrek aan voldoende hoeveelheden van de template DNA in kleine hoeveelheden water gefilterd (dwz 1-2 L). Hoewel eDNA concentratie van een bepaalde taxonomische groep onkenbaar is voor de versterking, filtratie van grote volumes water (> 1-2 L) zou een eenvoudige en effectieve manier om meer eDNA te halen op het aquatisch milieu met schaarse vis overvloed en biomassa, zoals open oceaan en de diepzee-ecosystemen.
Ten opzichte schijf vezelfilters gewoonlijk in een aantal vissen eDNA onderzoek 16, filterpatronen het voordeel opvang grotere waterhoeveelheden voor verstopping 17. Eigenlijk, een recente studie toonde groot volume (> 20 L) filtratie van de kust zeewater monsters met behulp van filter cartridges 18. Bovendien worden zij afzonderlijk verpakt en steriel en verschillende stappen van de experimentele workflow kan worden uitgevoerd in het filterhuis, waardoor de kans op besmetting door het laboratorium 19 verminderen. Het laatsteeigenschap is essentieel voor eDNA metabarcoding, waarbij het risico van verontreiniging blijft een van de grootste uitdagingen experimentele 20,21. Ondanks deze technische voordelen van de filter cartridges, is deze nog niet gebruikt in eDNA studies van vissen met twee uitzonderingen 8,15.
Hier bieden we een protocol voor filtratie van watermonsters met het filterpatroon en extractie van eDNA uit de filter zonder opengesneden de behuizing. We bieden ook twee alternatieve waterfiltratie systemen afhankelijk van de waterstand volumes (≤4 L of> 4 L). Om de prestaties van de nieuw ontwikkelde protocol en een eerder gebruikte protocol met behulp van een glasvezel filter in onze onderzoeksgroep 12,14,22,23 vergelijken, we voeren eDNA metabarcoding analyse van zeewater uit een enorme aquarium tank (7.500 m 3 ) met bekende soortensamenstelling en tonen het aantal gedetecteerde species afgeleid van de twee protocollen als representatieve resultaten. Dit protocol hzoals ontwikkeld voor metabarcoding eDNA van vissen, maar ook voor eDNA uit andere organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In veel metabarcoding studies met behulp van milieu monsters zoals water en bodem, post-filtratie behandeling van de filter cartridge is over het algemeen als volgt 24,25: 1) opensnijden of kraken van de behuizing met handgereedschap (slang mes of een tang); 2) verwijdering van het filter uit de patroon; en 3) het snijden van de filter in kleine stukjes met een scheermesje voor DNA-extractie. Om dergelijke omslachtige en tijdrovende procedures die gevoelig zijn voor besmetting in het laboratorium zijn, hebben…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a ‘snapshot’ of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA – a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J., DeLong, E. E. . Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. 10, 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K., Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. . Molecular Microbial Ecology Manual. , 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -. C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A., Micic, M. . Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples’Springer Protocols Handbooks. , 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
