Utilisation d'une cartouche filtrante pour la filtration de l'eau et des échantillons d'extraction de l'ADN de l'environnement
Summary
We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Abstract
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Introduction
ADN de l'environnement (EDNA) dans les milieux aquatiques se réfère au matériel génétique trouvé dans la colonne d'eau. Des études récentes ont démontré l'utilité de EDNA pour détecter les poissons de divers milieux aquatiques, y compris les étangs, les rivières 1-3 4-8, cours d' eau 9, et l' eau de mer 10-14. La plupart de ces études se sont concentrées sur la détection d'un seul ou de quelques invasive 1,4-6,8,14 et rares ou menacées espèces 3,9, alors que certaines études récentes ont tenté la détection simultanée de plusieurs espèces dans les communautés de poissons locales 7,9, 12,13,15 et mésocosmes 11,12.
Cette dernière approche est appelée «metabarcoding» et EdNA metabarcoding utilise un ou plusieurs ensembles d'amorces de PCR pour coamplify une région de gène à travers taxonomiquement divers échantillons. Elle est suivie par la préparation bibliothèque d'indexation et l'addition de l'adaptateur et les bibliothèques indexées sont analysées par un séquençage parallèle à haut débitPlate-forme. Récemment Miya et al. 12 ont développé des amorces de PCR universelles pour metabarcoding EDNA de poissons (appelés "MiFish"). Les amorces MiFish ciblent une région hypervariable du gène 12S ARNr mitochondrial (163-185 pb), qui contient des informations suffisantes pour identifier les poissons à la famille taxonomique, genre et espèce, sauf pour certains congénères étroitement liés. Avec l'utilisation de ces amorces dans EDNA metabarcoding, Miya et al. 12 détecté plus de 230 espèces marines subtropicales de réservoirs d'aquarium avec la composition des espèces et des récifs coralliens connus près de l'aquarium.
Tout en optimisant le protocole metabarcoding pour accueillir l'eau de mer naturelle avec des niveaux de concentration de poissons EDNA différents, nous avons remarqué que les amorces MiFish parfois échoué à amplifier la région cible pour la préparation de la bibliothèque ultérieure. Une des raisons les plus probables pour cette amplification PCR échec est le manque de quantités suffisantes de la template ADN contenu dans de petits volumes d'eau filtrée (ie 1-2 L). Bien que la concentration EDNA d'un groupe taxonomique spécifique est inconnaissable avant l'amplification, la filtration de grands volumes d'eau (> 1-2 L) serait un moyen simple et efficace pour recueillir plus EDNA des milieux aquatiques avec l'abondance des poissons rares et la biomasse, tels que ouvert sur la mer et en eaux profondes des écosystèmes.
Par rapport aux filtres en fibre de disques utilisés classiquement dans un certain nombre de recherches poissons EDNA 16, les cartouches filtrantes ont l'avantage d'accueillir de plus grands volumes d'eau avant le colmatage 17. En fait, une étude récente a montré un grand volume (> 20 L) filtration des échantillons d'eau de mer côtières en utilisant des cartouches filtrantes 18. En outre, ils sont emballés individuellement et stérile, ainsi que plusieurs étapes du flux de travaux expérimentaux peuvent être réalisés dans le boîtier de filtre, ce qui réduit la probabilité de contamination du laboratoire 19. Le dernierfonctionnalité est essentielle pour EDNA metabarcoding, où le risque de contamination reste parmi les plus grands défis expérimentaux 20,21. En dépit de ces avantages techniques des cartouches filtrantes, il n'a pas été utilisé dans les études EDNA de poissons à deux exceptions près 8,15.
Ici, nous fournissons un protocole pour la filtration des échantillons d'eau avec la cartouche filtrante et l'extraction de EDNA de son filtre sans avoir à couper ouvrir le boîtier. Nous fournissons également deux systèmes de filtration d'eau de remplacement en fonction des volumes d'eau (≤4 L ou> 4 L). Pour comparer les performances du protocole nouvellement développé et un protocole précédemment utilisé à l' aide d' un filtre en fibre de verre dans notre groupe de recherche 12,14,22,23, nous effectuons EDNA metabarcoding analyse de l' eau de mer à partir d' un énorme réservoir d'aquarium (7.500 m 3 ) avec la composition des espèces connues, et indiquer le nombre d'espèces détectées provenant des deux protocoles que des résultats représentatifs. Ce protocole hcomme été développé pour metabarcoding EDNA de poissons, mais est également applicable à EDNA d'autres organismes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans de nombreuses études de metabarcoding en utilisant des échantillons environnementaux tels que l' eau et le sol, le traitement post-filtration de la cartouche filtrante est généralement la suivante 24,25: 1) de coupe ouverte ou gerçures le boîtier avec des outils à main (coupe-tube ou une pince); 2) le retrait du filtre de la cartouche; et 3) la découpe du filtre en petits morceaux avec une lame de rasoir pour l'extraction d'ADN. Pour éviter de telles lourdes et longues procédures qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
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