Filtrasyon Su Örnekleri ve Çevre DNA Ekstraksiyon için bir Filtre Kartuşu Kullanımı
Summary
We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Abstract
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Introduction
su ortamlarında çevresel DNA (Edna'yı) su sütunu bulunan genetik malzemeyi ifade eder. Son çalışmalar, göletler 1-3, nehirler 4-8 dahil olmak üzere çeşitli su ortamlarında, gelen balıkları tespit etmek için Edna yararını göstermiştir 9 akarsu ve deniz suyu 10-14. Bazı yeni çalışmalar yerel balık toplulukları 7,9 birden fazla türün aynı anda algılama girişiminde ise bu çalışmaların çoğu, 3,9 tür tek veya birkaç invaziv 1,4-6,8,14 ve nadir ya da tehdit tespiti üzerinde duruldu 12,13,15 ve mesocosms 11,12.
İkinci yaklaşım, "metabarcoding" olarak adlandırılır ve Edna metabarcoding taksonomik çeşitli örnekleri arasında, bir gen bölgesini coamplify PCR primerleri, bir ya da birden fazla setleri kullanır. Bu dizin ve adaptör ek kütüphane hazırlanması tarafından takip edilir ve dizin kütüphaneler, yüksek verimli, paralel dizilemesi ile analiz edilmektedirplatformu. Son zamanlarda Miya ve ark., 12 ( "MiFish" olarak anılacaktır) balıklardan Edna metabarcoding için evrensel PCR primerleri geliştirdi. MiFish primerler taksonomik familya, cins ve bazı yakından ilgili Petkim'de hariç türlere balıklar belirlemek için yeterli bilgi içeren mitokondrial 12S rRNA geninin (163-185 bp), bir hiper-değişken bölgesini hedef. Edna metabarcoding bu primerlerin kullanımı ile Miya ve ark., 12 akvaryum yakın bilinen türlerin kompozisyonu ve mercan resifleri ile akvaryum tankları 230'dan fazla subtropikal deniz türleri tespit edildi.
metabarcoding protokolünü optimize balıklardan edna konsantrasyon düzeyleri değişen doğal deniz suyu karşılamak için, biz MiFish primerleri bazen sonradan kütüphane hazırlanması için hedef bölgeyi yükseltmek için başarısız olduğunu fark etmiş. Bu başarısız PCR amplifikasyonu daha muhtemel nedenlerinden biri TE yeterli miktarda olmamasıfiltre edilmiş su ve küçük miktarlarda ihtiva mplate DNA (örneğin 1-2 L). Belirli bir taksonomik grup edna konsantrasyonu büyük su hacimleri (> 1-2 L), filtrasyon amplifikasyonu önce bilinemez olmasına rağmen olur kıt balık bolluğu ve biyokütle gibi sucul ortamlarda daha Edna toplamak için basit ve etkili bir araç olabilir açık okyanus ve derin deniz ekosistemleri.
Disk fiber filtrelere Bağıl geleneksel balık edna araştırma 16 bir dizi kullanılır, filtre kartuşları 17 tıkanma önce büyük su hacimleri barındıran avantajına sahiptir. Aslında, yeni bir çalışma büyük hacimli (> 20 L) filtre kartuşları 18 kullanılarak kıyı deniz suyu numunelerinin filtrasyon gösterdi. Buna ek olarak, ayrı ayrı paketlenmiş ve steril ve deneysel iş akışının birkaç adım böylece laboratuvar 19 bulaşma olasılığını azaltarak, filtre konut yapılabilir vardır. İkincisiözelliği büyük deneysel 20,21 zorluklar arasında hangi bulaşma riski kalır edna metabarcoding için kritik öneme sahiptir. Filtre kartuşları bu teknik avantajlara rağmen, iki istisna 8,15 ile balıkların Edna çalışmalarında kullanılan olmamıştır.
Burada konut kesip açmak zorunda kalmadan kendi filtreden Edna filtre kartuşu ve çıkarma ile su örneklerinin filtrasyonu için bir protokol sağlar. Biz de su hacimleri (≤4 L veya> 4 L) bağlı olarak iki alternatif su filtrasyon sistemleri sağlamaktadır. Yeni geliştirilen protokol performansı ve Araştırma grubumuzda 12,14,22,23 bir cam elyaf filtre kullanılarak önceden kullanılan protokol karşılaştırmak için, biz Edna büyük bir akvaryum tankı deniz suyunun analizini metabarcoding gerçekleştirmek (7500 m 3 ) bilinen türlerin bileşimi ile ve temsilcisi sonuçları olarak iki protokol türetilen tespit türlerin sayısını gösterir. Bu protokol, Holarak balıklardan Edna metabarcoding için geliştirilmiş, ancak diğer organizmalardan Edna de uygulanabilir olmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Su ve toprak gibi çevresel numuneler kullanılarak birçok metabarcoding çalışmalarında aşağıdaki gibi filtre kartuşunun sonrası filtrasyon tedavi genellikle 24,25: 1) açık kesilmesi veya el aletleri (boru kesici veya pense) ile konut çatlama; 2) kartuştan filtrenin kaldırılması; ve 3) DNA ekstraksiyonu için bir jilet ile küçük parçalar halinde filtre kesilmesi. yaygın olarak kullanılan, ucuz ticari kiti kullanılarak filtre kartuşunun mahfaza içinde böyle hantal ve zaman alıcı la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a ‘snapshot’ of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA – a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J., DeLong, E. E. . Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. 10, 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K., Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. . Molecular Microbial Ecology Manual. , 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -. C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A., Micic, M. . Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples’Springer Protocols Handbooks. , 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
