Summary
פרוטוקול להפקת פיגמנטים מן גרגרי nanostructured ב כרומטופור דיונון Doryteuthis pealeii מוצג.
Introduction
דיונונים כגון דיונון, דיונון, תמנון יש את היכולת לשנות את המראה שלהם באופן דינמי עבור הסוואה ואיתות. 1-6 יכולת זו נתמכת בחלקה על ידי ההרחבה האזורית סלקטיבית של איברים פיגמנט המכונים כרומטופור. 4,7-9 כרומטופור הוא ומפעילים רכים המכילים רשת של גרגרי פיגמנט nanostructured הכלוא בתוך sacculus cytoelastic מעוגנים רדיאלית ידי סיבי שריר. 1,3 כפי שהם מופעלים, כרומטופור להרחיב ב -500% ב שטח פנים הציג הפצת גרגרי ברחבי האיברים. 3,7 , 10,11 כאשר פעולה זו מתואמת על פני מספר כרומטופור, הצבעוניות הכללית של החיה משתנית. אמנם ידוע כי גרגרי פיגמנט לתרום לשינוי הצבע הזה, הרכבן נותר עלום. אנו מתארים הליך לבודד ולטהר פיגמנטים כרומטופור אשר עשוי להיות מותאם ללימודי הלחנה בעתיד.
ss = "jove_content"> הבידוד של גרגרי פיגמנט כרוך מיצוי רב שלבים, המגון, הליך טיהור. 3,12 רקמה המכילה כרומטופור נאספה באמצעות כריתה זהירה מן סילוניות. תהליך העיכול ויצירת הומוגניות מכן נעשה שימוש כדי לנתק את הרקמה שמסביב ולהפריד התאים כרומטופור. גרגרי nanostructured אז הם מבודדים מטוהרים מן כרומטופור הנותר באמצעות sonication חוזרת צנטריפוגה. לאחר טיהור, פיגמנטים המחולצים הגרגירים תהליך מותאמת החילוץ של צבע גלוי כנפי הפרפר באמצעות פתרונות מתנול חומצי. 13 במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ו spectrophotometry משמשים כדי לאשר את הפיגמנטים כרומטופור המחולצים בהצלחה באמצעות תהליך זה.
שיטה זו מתארת את הבידוד של גרגרי כרומטופור המשמש לחקור את התרומות המולקולריות גoloration ב דיונונים. 12 עקירות מולקולה קטנה מחיות כולו לעתים קרובות יכול להיות תהליך ארוך ומייגע. המטרה כאן היא ליידע חוקרים עתידיים של פרוטוקול יעיל קליל לרכישת פיגמנטים מן הגרגרים nanostructured ב דיונונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקרים בבעלי חיים חסרי חוליות שנערכו במסמך זה אינם מוסדרים בארצות הברית; ולכן ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש אין סמכות לבדיקה של פרוטוקולים כאלה. במקום אלה לא נופלים תחת תחום השיפוט של רגולציה בארצות הברית, בזאת המחברים קובעים כי המחקרים הללו נערכו עם מאמץ כנה כלפי השימוש האתי, טיפול, וטיפול של בעלי חיים אלה, את מספר האנשים היה ממוזער ומאמצים אלה עולה בקנה אחד עם הנחיות אתיקת הכרזת המועצה הבינלאומית באזל למדע בעלי חי מעבדה (ICLAS).
1. pealeii Doryteuthis (ד pealeii) Dissection
- דיונון הרכישה הערוף ד pealeii ממח' המשאבים הימיים במעבדה לביולוגיה הימית בוודס הול, MA או מכל שוק דגים טריים. אין להשתמש דגימות כי כבר שפרוסות או שינה קודמים כדי שתוכל להחיל הליך זה. באופן ספציפי, chromaשכבת tophore עדיין חייבת להיות ללא שינוי על הדגימה.
- אם בעלי החיים אינם משמשים מיד, לאחסן אותם ב -20 ° C עד השימוש. כדי להפשיר את דגימות, למקם אותם במים בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 לפני לנתיחה.
- בעזרת מספריים לנתיחה קנס נקודות ישר נירוסטה, לחתוך לאורך הצד האחורי של החיה. בגין בבסיס מעטפת הגחון, ולסיים ב באזור הסנפיר.
- הסר את כל האיברים הפנימיים (בטן, זימים, בלוטת דיו, אברי רבייה, לב מערכתי, ולב זרוע) על ידי הרמה אותם עם לנתח מלקחי ניתוק רקמת החיבור שלהם באמצעות מספריים לנתיחה. בטל איברים בתוך שקית דגימה.
- השתמש לנתח T-סיכות להצמיד המעטפת (צד סנפיר למעלה) בתוך 2 תקן 11-1 / "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "פאן לנתיחה אלומיניום המכיל כרית לנתיחה גמישה. להטביע את הרקמה 250 מיליליטר של מי ים כי סונן דרך מערכת סינון ואקום קלקר חד פעמיהמכיל גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר.
- מוציאים בזהירות את שכבת העור אפידרמיס (צבע אטום) עם מלקחיים לנתח, משאיר את שכבת העור המכיל כרומטופור ללא פגע. לאחר שכבת אפידרמיס מוסר, וזורק אותו בשקית דגימה.
- לנתח קטן (1 ס"מ x 1 ס"מ) סעיפים של השכבה כרומטופור עם מלקחיים ומספריים דיסקציה. לאסוף דגימות ב 1.5 מ"ל צינורות מיקרו צנטריפוגות (למלא מחצית צינור אחד ריק עם הרקמה גזור).
- הוסף 500 μl של מי ים מסונן אל הרקמה המכילה צינורות. הדגימות ניתן לאחסן לילה בשעה 4 ° C..
2. בידוד כרומטופור גרגרי פיגמנט
- עיכול רקמות
- הכנת Papain / collagenase
- תשקול 30 מ"ג של collagenase ו -5 מ"ג פפאין באמצעות חנקן 4 "x 4" נמוך לשקול נייר. העבר אלה לתוך צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ"ל עם ראש מתברג.
- מדוד 10 מ"ל של deionizמי ed בעזרת פיפטה בוגרת. להוסיף ישירות בקבוקון המכיל פפאין / collagenase. וורטקס על ההגדרה הגבוהה ביותר עד הפתרון הוא ברור.
- הסרת רקמות תאיות
- צנטריפוגה רקמת כרומטופור שנאספו צעד 1.7 במשך 5 דקות ב 14,000 x ז. מחק את השכבה העליונה של מי ים לתוך דלי פסולת פלסטיק.
- הוסף 500 μl של פתרון פפאין / collagenase אל הרקמה באמצעות micropipette ערוץ יחיד משתנה נפח P1000. וורטקס כל מדגם למשך 1-2 דקות על ההגדרה הגבוהה ביותר.
- Sonicate את הדגימות למשך 5 דקות בתדירות של 40 kHz לנתק תאים מן הרקמה הסובבת.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 14,000 x. בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק.
- צנטריפוגה רקמת כרומטופור שנאספו במשך 5 דקות ב 14,000 x ז. מחק את השכבה העליונה של מי ים לתוך דלי פסולת פלסטיק. חזור שוב.
- הסרה ידנית כל שניות רקמה גדולות הנותרותמשא שלא לעכל בתהליך זה עם מלקחיים לפני שתמשיך לשלב הבא.
- הכנת Papain / collagenase
- בידוד גרגרי פיגמנט
- הכנת מאגר המגון
- לשקול 2.38 גר '(4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES, 100 מ"מ), 0.095 גרם של מגנזיום כלוריד (10 מ"מ), 0.856 גרם של-אספרטט אשלגן (50 מ"מ), ו 0.015 גרם של dithiothreitol (1 מ"מ). העבר לתוך מיכל קלקר 150 מ"ל עם ראש מתברג. להוסיף אחד מעכב פרוטאז Tablet מיני מסחרי.
- מדוד 100 מ"ל מים ללא יונים באמצעות גליל סיים. להוסיף ישירות מיכל המכיל מלחי המגון. וורטקס עד הפתרון הוא ברור.
- המגון של גרגרי פיגמנט
- צנטריפוגה מדגם משלב 2.1 ב 14,000 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק. מדגם זה אמור להיות ריק רקמת תאי.
- הוספת 500 &# 181; l של חיץ homogenization כדי צינור כל מערבולת במשך 1-2 דקות כל אחד לערבב את הדגימות ביסודיות. Sonicate את הדגימות למשך 30 דקות (~ 40 kHz) ופעל עם 5 דקות של צנטריפוגה ב 14,000 x ז.
- בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק, חזור על השלב הקודם 2-3 פעמים כדי להבטיח את העיכול המלא של רצועות sacculus וחלבון כרומטופור. הפתרון הנותר צריך להכיל supernatant אור צהובה גלולה אדומה בצבע המכיל את גרגרי פיגמנט מבודדים.
- הכנת מאגר המגון
3. הפקת פיגמנט
- הכנת מתנול חומציים (HCl-MeOH)
- בזהירות להוסיף 25 μl של מרוכז (36.5-38% (w / w)) חומצה הידרוכלורית (HCl) עד 5 מ"ל של מתנול (MeOH). אחסן את הפתרון HCl-MeOH בבקבוקון מדגם זכוכית מתברג. מערבולת בעדינות לתערובת הפתרון באופן אחיד.
הערה: ככל חומצי הפתרון, הפיגמנט יותר יחולצו במהלך fiחילוץ ראשון.
- בזהירות להוסיף 25 μl של מרוכז (36.5-38% (w / w)) חומצה הידרוכלורית (HCl) עד 5 מ"ל של מתנול (MeOH). אחסן את הפתרון HCl-MeOH בבקבוקון מדגם זכוכית מתברג. מערבולת בעדינות לתערובת הפתרון באופן אחיד.
- הפקת פיגמנט
- צנטריפוגה ההשעיה גרגר פיגמנט (מ 2.2.2) במשך 5 דקות ב 14,000 XG וזורקים supernatant לדלי פסולת פלסטיק.
- הוסף 500 μl של פתרון HCl-MeOH מערבולת מדגם עבור ~ 3-4 דקות. Sonicate את הדגימות למשך 10 דקות (~ 40 kHz), ואז צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 14,000 x.
- בעזרת פיפטה העברה, לאסוף את supernatant בבקבוקון זכוכית 1 DRAM הברגה. את supernatant צריך להיות אדום כהה.
- חזור על 3.2.2 מיצוי שלב עד אין צבע נוסף מופק (~ 4-5 שוטף).
הערה: כל חילוץ יניב ~ 1.5 מיליליטר של פיגמנט. הגלולה חסרת הצבע שנותרת היא גרגרי חילוץ פיגמנט. הערה: שני גרגרי צבע ופיגמנטים שחולצו ניתן לאחסן מים ב 4 ° C עד לשימוש נוסף.
4. אפיון לאורך תהליך החילוץ
- El סריקהמיקרוסקופי ectron
- גרגרי לתמונה (unreacted משלב 2.2.1 ו-חילוץ פיגמנט משלב 3.2.3) באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לאמת את הטוהר של תהליך החילוץ.
- כדי להכין דוגמאות גרגיר הדמיה, צנטריפוגה הראשונה הוא גרגרי unreacted וגרגרי חילוץ פיגמנט במשך 5 דקות ב 14,000 XG, וזורקי supernatant לדלי פסולת פלסטיק. Re- להשעות אלה ב 1 מ"ל של אתנול, והפקדת 2-3 טיפות של השעיה גרגיר על הספחים SEM אלומיניום בעזרת פיפטה ההעברה.
- לאחר ייבוש דגימות לילה, גמגום מעיל עם ציפוי זהב-פלטינה במשך 3 דקות כדי להשיג ציפוי 15 ננומטר.
- תמונה באמצעות SEM עם פולט שוטקי וגלאי אלקטרונים משניים. השתמש מתח קורה 5-7 ק ו ו מרחק עבודה בין 8 ו -9 מ"מ לתמונת חומרים אלה.
- Ultraviolet-גלוי (UV-VIS) מדידות spectrophotometric
- לפקח על פרו ספיגתקבצים עבור כל 3 התנאים (גרגיר unreacted מן 2.2.2, פיגמנט מופק 3.2.3, וגרגרי חילוץ פיגמנט מ 3.2.4) באמצעות ספקטרופוטומטר קרן כפול מ 200-800 ננומטר.
- אסוף מדידה ריק באמצעות מים ללא יונים ב קובט 1 מ"ל עבור גרגרי unreacted ואת גרגרי חילוץ פיגמנט. אסוף ספקטרום ספיגת UV-Vis הן דוגמאות.
- אסוף מדידה ריק באמצעות פתרון מתנול חומצי קובט 1 מ"ל עבור הפיגמנט חילוץ. אסוף ספקטרום ספיגת UV-Vis למדגם.
- לקבוע אורך גל מרבי של כל דגימה על ידי זיהוי את אורך הגל שבו השיא הספיג מגיע לגובה ביחס המקסימלית שלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כרומטופור הוא גזור מן ד המעטפת הגבי pealeii (איור 1A, 1B). ברגע שהם מוסרים, כרומטופור הם lysed ו מטוהרים באמצעות מחזורים צנטריפוגה ושטיפת לבודד את גרגרי פיגמנט (איורים 2A, 2B). פתרונות מתנול חומציים (HCl-MeOH) משמשים כדי לחלץ את הפיגמנט מן הגרגירים (איור 2 ג), מניב תמצית פיגמנט מסיס גרגירי חילוץ פיגמנט מסיסים, חסרי צבע.
תהליך החילוץ מקטין את הקוטר הממוצע של הגרגרים. זו נצפתה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). לפני הגרגרים נחשפים HCl-MeOH, יש להם קוטר ממוצע של (527.3 ± 91.8) ננומטר (N = 100, שגיאה היא סטיית התקן; איור 3 א). כאשר הפיגמנט מופק גרגירים, הירידה גודלs ל (202.6 ± 32.2) ננומטר (N = 100, השגיאה היא סטיית התקן; איור 3). צמצום גודל זה שער להיות בשל המיצוי של פיגמנט מן הגרגיר כאשר טופל HCl-MeOH.
כדי לבחון השערה זו, ההבדלים טרום גלוי צבע והפקת פוסט מנוטרים באמצעות מיקרוסקופיה spectrophotometry אור. עם תוספת של HCl-MeOH, צבע המשויך גרגרי unreacted מפחית בעליל (איור 4 א). זה מאופיין נוסף באמצעות spectrophotometry UV-VIS (איור 4B), שם פרופיל ספיג רחב (~ 280-800 ננומטר) הוא ציין עבור הגרגרים מראש חילוץ גרגרים שלאחר חילוץ, אם כי בעצימות נמוכות בהרבה; בעוד, תמצית פיגמנט מסיסה מפגין מקסימום למבדה מרוכז ב ~ 500 ננומטר, עם כתף ב ~ 380 ננומטר. ביחד, נתונים אלה מראים שיטה כדי לחלץ את הצבע הגלוי בהצלחה מן הגרגרים.
איור 1: כרומטופור מ דיונון ד pealeii. (א) קלמארי ד מעטפת הגבה pealeii. (ב) תמונה בשדה בהירה של אדום, צהוב, חום כרומטופור. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. איור של תהליך החילוץ (א) כרומטופור הם גזורים. (ב) גרגרי פיגמנט יוסרו מרקמות כרומטופור הומוגני מטוהרים באמצעות סדרה של מחזורי צנטריפוגה ושטיפה. (C) הפיגמנט יכול להיות לשעבר tracted מן הגרגרים באמצעות HCl-MeOH מניב supernatant פיגמנט מסיס אשר מופרד גרגרי חילוץ פיגמנט הצבע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: בקטרים אלטר החילוץ HCl-MeOH של גרגרי nanostructured micrographs אלקטרונים סורק של (א) גרגרי פיגמנט מראש חומצי חילוץ מתנול (B) פוסט-חומצי גרגרי פיגמנט חילוץ מתנול.. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
להעלות / 54,803 / 54803fig4.jpg "/>
איור 4: מיצוי HCl-MeOH משנה צבע גלוי של גרגרי nanostructured (א) תמונות שדה מוארת של גרגרי פיגמנט לאורך כל תהליך החילוץ.. (ב) ספקטרום ספיג של טרום (שחור) - ופוסט (כחול) -. חילוץ יחד עם supernatant פיגמנט (אדום) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנחנו הוכחנו שיטה לחלץ פיגמנטים מתוך גרגרי כרומטופור דיונון. על ידי מיקוד הגרגרים במיוחד, המטרה שלנו היא לקבוע את תפקידם לתווך צבע אדפטיבית. שיטה זו בשונה מדוחות קודמים נועד לאפיין פיגמנטים סילוניות באמצעות דגימות רקמה בתפזורת 14 או מיובש בהקפאה העור 15.
בעוד פרוטוקול זה הוא יעיל לחילוץ פיגמנטים כרומטופור, היא מוגבלת קשקשי תגובה קטנים. ביתור אחד תשואות דיונון ~ 11 מ"ג של גרגרי מטוהרים. כ -58% ממסה זה מכיל פיגמנט המסיס, אשר מופק באמצעות פתרון HCl-MeOH. 12 טוהר רקמת כרומטופור החל השפיע באופן ישיר על תשואת המוצר לנתיחה אחד. אם הדגימות להופיע מזוהמת אפידרמיס עודף או רקמות iridophore שנאספו במהלך הניתוח, עדיף להפריד את תוכנו של המדגם, resuspend אותם buf נוספיםfer, ולהתחיל את המגון צעדים ושוב. בידוד אוכלוסייה טהורה של גרגרי פיגמנט מרקמות כרומטופור עלול לקחת כמה שרק שמונה, 4 מחזורים sonication hr כי יכלו לגשר על פני 4 ימים. חשוב להתאזר בסבלנות בבידוד כדי להבטיח אוכלוסייה טהורה של גרגרי פיגמנט.
טוהר פתרון הגרגיר החל גם משפיע על צעדי חילוץ פיגמנט עם HCl-MeOH. אם הגרגרים הם האפילו על ידי רקמות מעוכלות, פשוט מערבולת sonicate הדגימות עד 1 שעה ו homogenize מדגם לפני תחילת החילוץ שוב. לעתים קרובות 4-5 שוטף באמצעות 500 μl של HCl-MeOH לדגימה נדרשים כדי לחלץ את הפיגמנט מן הגרגרים. אם נעשה בצורה נכונה, הליך זה יניב בין 2-3 מיליליטר של פיגמנט המסיס לדגימה. כאשר טיהור נוספת מועסקת באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה, הפיגמנטים המבודדים להפריד לארבעה שברים ייחודיים המכילים ריכוזים שונים של xanthommatin ו decarboxylated xanthommatin. 12
שיטה זו יכולה להיות מנוצלת על ידי כימאים, ביולוגים, או למהנדסים להבין טוב יותר את תפקידו של הפיגמנטים אפנון צבע. הנוכחות של פיגמנט בתוך הגרגרים מציעה מנגנון הירארכי הצבע ב דיונונים שמקורו עם הרכיבים המולקולריים בתוך גרגרי פיגמנט nanostructured כרומטופור. ממצאים אלו יכולים לשמש כדי ליידע מערכות הנדסה שנועדו לחקות את הטווח הדינמי של צבע אדפטיבית המוצג דיונונים באמצעות חלקיקים פיגמנט ארוז מראש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
- Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
- Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2004).
- Deravi, L. F., et al. The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores. J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).
- Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods. J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid. Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores. Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).
- Cloney, R. A., Brocco, S. L. Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods. Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).
- Hanlon, R. T., Messenger, J. B. Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).
- Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects. J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).
- Florey, E. Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores. Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).
- Florey, E., Kriebel, M. E. Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs. Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).
- Williams, T. L., et al. Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores. Langmuir. , (2016).
- Nijhout, H. F. Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae). Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).
- Van Den Branden, C., Decleir, D. A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis. L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).
- Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).
