Summary
Um protocolo para a extração de pigmentos a partir dos grânulos nanoestruturados em lulas Doryteuthis pealeii cromatóforos é apresentado.
Introduction
Cefalópodes, tais como lulas, chocos, polvo e tem a capacidade de alterar dinamicamente a sua aparência para camuflar e sinalização. 1-6 Esta capacidade é apoiado em parte pela expansão de área seletiva de órgãos pigmentadas conhecidos como cromatóforos. 4,7-9 Cromatóforos são actuadores macias que contêm uma rede de grânulos de pigmento nanoestruturados confinados dentro de uma sáculo cytoelastic que está ancorado radialmente por fibras musculares. 1,3 Como eles são actuados, chromatophores expandir por 500% da área de superfície apresentada a distribuição dos grânulos durante todo o órgão. 3,7 , 10,11 Quando esta acção concertada ao longo de um número de chromatophores, a coloração geral do animal é alterada. Embora se saiba que os grânulos de pigmento contribuir para esta mudança de cor, a sua composição permanece desconhecido. Descreve-se um processo para isolar e purificar chromatophore pigmentos que podem ser adaptados para futuros estudos de composição.
3,12 chromatophore tecido contendo é colhido através de extirpação cuidado do cefalópode. Um processo de digestão e homogeneização é então utilizado para dissociar o tecido circundante e separar as células chromatophore. Os grânulos nanoestruturados são, em seguida, isolado e purificado a partir das chromatophores restantes usando sonicação e centrifugação repetida. Após purificação, os pigmentos são extraídos a partir dos grânulos em um processo que é uma adaptação da extracção de cor visível de asas de borboleta usando soluções de metanol ácidas. Microscopia de electrões 13 de varredura (SEM) e espectrofotometria são usados para confirmar que os pigmentos chromatophore são extraídas com sucesso usando Este processo.
Este método descreve o isolamento de grânulos chromatophore que é usado para explorar as contribuições para C molecularesoloration em cefalópodes. 12 extrações de moléculas pequenas de animais inteiros muitas vezes pode ser um processo longo e tedioso. O objetivo aqui é informar futuros pesquisadores de um protocolo eficaz e fácil para a aquisição de pigmentos a partir dos grânulos nanoestruturados em cefalópodes.
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Protocol
estudos com animais invertebrados aqui realizados não são regulamentados nos Estados Unidos; Por conseguinte, o Comité Cuidado e Uso Institucional animal não tem autoridade para revisão de tais protocolos. Em vez de estes não estão sob a jurisdição da regulação nos Estados Unidos, os autores declaram que estes estudos foram realizados com esforço sincero para o uso ético, cuidado e tratamento destes animais, o número de indivíduos foi minimizado e estes esforços são consistentes com a Declaração de Basileia e do Conselho Internacional para a Ciência animal Laboratory (ICLAS) diretrizes de ética.
1. Doryteuthis pealeii (pealeii D.) Dissection
- Compra lulas decapitado D. pealeii do Departamento de Recursos Marinhos no Laboratório de Biologia Marinha de Woods Hole, MA ou de qualquer mercado de peixe fresco. Não utilizar amostras que foram filetes ou previamente alteradas, a fim de aplicar este procedimento. Especificamente, a cromacamada tophore deve ainda estar intacto na amostra.
- Se os animais não são utilizados imediatamente, armazená-las a -20 ° C até à sua utilização. Para descongelar os espécimes, colocá-los em água a temperatura ambiente por 1 hora antes da dissecção.
- Usando aço inoxidável retas tesouras de dissecação de ponta fina, cortados ao longo do lado posterior do animal. Comece na base do manto ventral, e termina na região fin.
- Remover todos os órgãos internos (estômago, de emalhar, glândula de tinta, órgãos reprodutores, coração sistêmica e coração braquial), levantando-los com dissecando uma pinça e cortar seu tecido conjuntivo usando tesouras de dissecação. Descarte órgãos em um saco de amostra.
- Use dissecando T-pinos para fixar o manto (lado fin-se) em um padrão 11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "pan dissecção de alumínio contendo uma almofada dissecção flexível. Mergulhe o tecido em 250 ml de água do mar que foi filtrada através de um sistema de filtração em vácuo de poliestireno descartáveiscontendo 0,2 uM tamanhos de poro.
- Remova cuidadosamente a camada de pele epidérmico (cor opaca) com uma pinça de dissecação, mantendo a camada de pele chromatophore contendo intacta. Uma vez que a camada epidérmica é removido, descartá-lo num saco de amostra.
- Dissecar pequenas seções (1 cm x 1 cm) da camada chromatophore com uma pinça e tesouras de dissecação. Recolher amostras de 1,5 ml em tubos de micro-centrifugação (preencher uma metade de cada tubo vazio com o tecido dissecado).
- Adicionar 500 uL de água do mar filtrada para o tecido contendo tubos. As amostras podem ser armazenadas durante a noite a 4 ° C.
2. Isolando chromatophore Pigment Granulados
- digestão do tecido
- Preparação da papaína / colagenase
- Pesar 30 mg de colagenase e 5 mg de papaína usando um "x 4" baixo teor de azoto 4 pesar papel. Transferi-los em um 50 ml tubo de centrífuga de polipropileno com tampa de rosca.
- Medir 10 ml de deionizágua ed usando uma pipeta graduada. Adicionar directamente ao frasco contendo papaína / colagenase. Vortex na configuração mais alta até que a solução é clara.
- Remoção de tecido extracelular
- Centrifuga-se o tecido recolhido a partir do passo chromatophore 1,7 durante 5 min a 14.000 x g. Descartar a camada superior da água do mar em um balde de resíduos de plástico.
- Adicionar 500 ul da solução de papaína / colagenase ao tecido usando uma P1000 de volume variável único canal micropipeta. Vortex cada amostra por 1-2 min na potência máxima.
- Sonicar as amostras durante 5 minutos a uma frequência de 40 kHz para dissociar as células a partir do tecido circundante.
- Centrifugar durante 5 min a 14.000 x g. Descartar o sobrenadante em um balde de resíduos de plástico.
- Centrifuga-se o tecido recolhido chromatophore durante 5 min a 14.000 x g. Descartar a camada superior da água do mar em um balde de resíduos de plástico. Repita mais uma vez.
- remover manualmente qualquer sec tecido grande restantesções que não digerem neste processo com uma pinça antes de prosseguir para o passo seguinte.
- Preparação da papaína / colagenase
- Isolando o pigmento Granulados
- Preparação de tampão de homogeneização
- Pesar 2,38 g de (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico) (HEPES, 100 mM), 0,095 g de cloreto de magnésio (10 mM), 0,856 g de potássio-aspartato (50 mM), e 0,015 g de ditiotreitol (1 mM). Transferir para um recipiente de poliestireno de 150 ml com uma tampa de rosca. Adicionar um mini-inibidor de protease tablet comercial.
- Medir 100 mL de água desionizada usando um cilindro graduado. Adicionar directamente ao recipiente que contém os sais de homogeneização. Vortex até a solução ficar clara.
- Homogeneização dos grânulos de pigmento
- Centrifugar cada amostra a partir do passo 2.1 a 14000 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante em um balde de resíduos de plástico. Essa amostra deve ser vazio de tecido extracelular.
- Adicionar 500 &# 181; l de tampão de homogeneização e a cada tubo de vórtice durante 1-2 min cada para misturar bem as amostras. Sonicate as amostras para 30 min (~ 40 kHz) e seguir com 5 min de centrifugação a 14.000 x g.
- Descartar o sobrenadante para um balde de desperdícios de plástico, e repetir a etapa anterior de 2-3 vezes para assegurar a digestão completa do sáculo e chromatophore proteína amarras. O restante da solução deve conter um sobrenadante de cor amarela clara e um pelete de cor vermelha contendo os grânulos de pigmento isolado.
- Preparação de tampão de homogeneização
3. Pigment Extração
- Preparação de metanol ácido (HCl-MeOH)
- Adicionar cuidadosamente 25 mL de concentrado (36,5-38% (w / w)) de ácido clorídrico (HCl) a 5 ml de metanol (MeOH). Guardar a solução HCl-MeOH num frasco de amostra de vidro com tampa de rosca. Agite cuidadosamente para misturar uniformemente a solução.
NOTA: O mais ácida à solução, a mais pigmento será extraído durante o fiextração de primeira.
- Adicionar cuidadosamente 25 mL de concentrado (36,5-38% (w / w)) de ácido clorídrico (HCl) a 5 ml de metanol (MeOH). Guardar a solução HCl-MeOH num frasco de amostra de vidro com tampa de rosca. Agite cuidadosamente para misturar uniformemente a solução.
- Extracção de Pigmento
- Centrifugar a suspensão de pigmento de grânulos (a partir de 2.2.2) durante 5 min a 14000 xg e desprezar o sobrenadante para um balde de desperdícios de plástico.
- Adicionar 500 ul da solução de HCl-MeOH e agitar com vortex para cada amostra de ~ 3-4 min. Sonicar as amostras durante 10 min (~ 40 kHz), depois centrifugar durante 5 min a 14.000 x g.
- Usando uma pipeta, recolher o sobrenadante num frasco com tampa de vidro de 1 dram. O sobrenadante deve ser vermelho escuro na cor.
- Repita o 3.2.2 etapa de extração até que este é extraído (~ 4-5 lavagens).
NOTA: Cada extracção irá produzir ~ 1,5 mL de pigmento. O sedimento incolor remanescente é extraída os grânulos de pigmento. NOTA: Ambos os grânulos incolores e pigmentos extraídos podem ser armazenados em água a 4 ° C até uso posterior.
4. Caracterização ao longo Processo de Extracção
- digitalização Electron Microscopia
- Imagem dos grânulos (que não reagiram a partir do passo 2.2.1 e 3.2.3 do passo extraiu-pigmento) usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) para verificar a pureza do processo de extração.
- Para preparar as amostras de grânulos para imagiologia, primeiro de centrifugação tanto grânulos que não reagiram e de pigmento extraído grânulos durante 5 min a 14.000 xg, e desprezar o sobrenadante para um balde de desperdícios de plástico. Re-suspender estes em 1 ml de etanol, e depósito de 2-3 gotas da suspensão de grânulos Onto topos de alumínio SEM utilizando uma pipeta de transferência.
- Depois de se secar as amostras durante a noite, revestir com revestimento de ouro-platina durante 3 min para obter um revestimento de 15 nm.
- Imagem usando um MEV com um emissor de Schottky e um detector de electrões secundário. Use uma tensão feixe de 5-7 kV e uma distância de trabalho entre 8 e 9 mm para a imagem destes materiais.
- Usando espectrofotometria ultravioleta-visível (UV-VIS)
- Monitorar o pro absorçãoarquivos para todas as 3 condições (grânulos que não reagiu a partir 2.2.2, pigmento extraído do 3.2.3, e pigmento extraído grânulos de 3.2.4) usando um espectrofotômetro de feixe duplo 200-800 nm.
- Recolha uma medição em branco utilizando água desionizada numa cuvete de 1 mL para os grânulos que não reagiram e os grânulos de pigmento extraído. Recolha espectros de absorção UV-Vis para ambas as amostras.
- Recolha uma medição em branco utilizando a solução de metanol ácido numa cuvete de 1 ml para o pigmento extraído. Recolha espectro de absorção UV-Vis para a amostra.
- Determinar o comprimento de onda máximo de cada amostra por meio da identificação do comprimento de onda em que o pico de absorvância atinge a sua altura máxima relativa.
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Representative Results
Cromatóforos são dissecados a partir do D. pealeii manto dorsal (Figura 1A, 1B). Uma vez que são removidas, chromatophores são lisadas e purificada utilizando ciclos de centrifugação e lavagem para isolar os grânulos pigmentados (Figuras 2A, 2B). Soluções de metanol ácido (HCl-MeOH) são usadas para extrair o pigmento a partir dos grânulos (Figura 2C), obtendo-se um extracto de pigmento solúvel e, em grânulos, extraiu-pigmentos incolores insolúveis.
O processo de extracção reduz o diâmetro médio dos grânulos. Isto é observado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Antes de os grânulos são expostos a HCl-MeOH, que têm um diâmetro médio de (527,3 ± 91,8) nm (n = 100, o erro é o desvio padrão; Figura 3A). Quando o pigmento é extraído a partir dos grânulos, a diminuição de tamanhos para (202,6 ± 32,2) nm (n = 100, o erro é o desvio padrão; A Figura 3B). Esta redução de tamanho é a hipótese de ser devido à extracção de pigmento a partir de grânulo quando tratado com HCl-MeOH.
Para testar esta hipótese, as diferenças de pré-cor visível e extração de pós são monitorados através de microscopia de luz e espectrofotometria. Após a adição de HCl-MeOH, a cor associada com os grânulos que não reagiram reduz visivelmente (Figura 4A). Isto é ainda caracterizado através de espectrofotometria de UV-vis (Figura 4B), onde um amplo perfil de absorvância (~ 280-800 nm) é observada para os grânulos pré-extraiu-se grânulos e pós-extraída, embora com uma intensidade muito mais baixa; enquanto que, o extracto de pigmento solúvel exibe um lambda max centrado em ~ 500 nm, com um ombro a 380 nm ~. Colectivamente, estes dados sugerem um método de extrair com sucesso a cor visível a partir dos grânulos.
Figura 1: Cromatóforos de D. squid pealeii. (A) Squid D. manto dorsal pealeii. (B) imagem Campo brilhante do cromatóforos vermelho, amarelo e marrom. Barra de escala = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Ilustração do processo de extracção Cromatóforos (A) são dissecados. (B) grânulos de pigmento são removidos a partir de tecido homogeneizado chromatophore e purificado utilizando uma série de ciclos de centrifugação e lavagem. (C) O pigmento pode ser ex traída a partir dos grânulos utilizando HCl-MeOH obtendo-se um sobrenadante pigmento solúvel que é separado dos grânulos de pigmento incolor extraídos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: HCl-MeOH diâmetros extracção Altera dos grânulos nanoestruturados micrografias electrónicas de varrimento de metanol pré-ácida extraiu-se grânulos de pigmento (A) e (B) de metanol-ácido pós extraída grânulos de pigmento.. Barra de escala = 1 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4: HCl-MeOH extracção altera a cor visível de grânulos nanoestruturados (A) as imagens de campo claro de grânulos de pigmento ao longo do processo de extracção.. (B) espectro de absorção dos pré (preto) - e pós (azul) -. Extracção juntamente com o sobrenadante pigmento (vermelho) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós demonstramos um método para extrair pigmentos a partir de grânulos chromatophore lula. Alvejando especificamente os grânulos, o nosso objectivo é determinar seu papel na mediação coloração adaptativa. Este método difere relatórios anteriores concebidos para caracterizar pigmentos cefalópodes utilizando amostras de tecidos em massa 14 ou liofilizados pele 15.
Embora este protocolo é eficaz na extração de pigmentos chromatophore, ela é limitada a pequenas escalas de reação. Dissecando um rendimento de lula ~ 11 mg de grânulos purificados. Cerca de 58% desta massa contém o pigmento solúvel, o qual é extraída com solução de HCl-MeOH a 12. A pureza do tecido chromatophore começando influencia directamente o rendimento do produto a partir de uma dissecção. Se as amostras contaminadas por apareça excesso epidérmica ou tecido iridophore recolhidos durante a dissecção, é melhor para separar o conteúdo da amostra, ressuspender-los em buf adicionalfer, e começar a homogeneização passos outra vez. Isolar uma população pura de grânulos de pigmento de tecido chromatophore pode demorar até oito, 4 ciclos hr sonicação que poderiam se estendem por 4 dias. É importante manter a paciente no isolamento para garantir uma população pura de grânulos de pigmento.
A pureza da solução de partida de grânulos também influencia os passos de extracção do pigmento com HCl-MeOH. Se os grânulos são ocluídas por tecido não digerido, simplesmente vórtice e sonicar as amostras até 1 hora e homogeneizar a amostra antes de iniciar a extracção mais uma vez. Frequentemente 4-5 lavagens utilizando 500 mL de HCl-MeOH por exemplo são necessárias para extrair o pigmento a partir dos grânulos. Se feito corretamente, este procedimento irá produzir entre 2-3 ml de pigmento solúvel por amostra. Quando a purificação adicional é empregue através de cromatografia em camada fina, os pigmentos isolado separar-se em quatro fracções únicas contendo concentrações variáveis de xantomatina e decarboxantomatina xylated. 12
Este método pode ser utilizado por químicos, biólogos ou engenheiros para entender melhor o papel dos pigmentos na modulação da cor. A presença do pigmento dentro dos grânulos sugere um mecanismo hierárquico para a coloração em que se origina cefalópodes com os componentes moleculares contidas dentro dos grânulos de pigmento chromatophore nanoestruturada. Estes resultados podem ser utilizados para informar Engineered sistemas concebidos para imitar a gama dinâmica de adaptação de cor exibida em cefalópodes utilizando nanopartículas pigmentadas pré-embalados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
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