Histologische kwantificering van chronische hartinfarct bij ratten
Summary
The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.
Abstract
Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.
Introduction
Myocardinfarct (MI) is een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit wereldwijd. Coronaire hartziekten is de belangrijkste oorzaak; MI het gevolg is van ischemie opeenvolgende coronaire gebeurtenissen, zoals occlusie. Wanneer reperfusie niet binnen de eerste 6 uur wordt uitgevoerd, ischemie veroorzaakt onomkeerbare myocardiale necrose. Bij patiënten, de karakterisering van MI berust op verschillende diagnostische instrumenten, met inbegrip van de klinische symptomen, elektrocardiografie, evaluatie van de plasma niveaus van biomarkers, echocardiografie, MRI, en histologische analyses 1. Acute en chronische MI worden als twee verschillende fasen van de schade van het tijdstip van de myocardiale necrose in verhouding tot de tijd van de coronaire occlusie. De acute fase die gedurende de eerste 7 dagen, wordt het verloren gaan van cardiomyocyten, uitgebreide ontsteking en de rekrutering van fibroblasten. De sub-acute fase, gekenmerkt door de genezing van hartweefsel en de vorming van een litteken, treedttussen 1 en 4 – 6 weken. Uitbreiding van het infarct, ventrikel wand dunner, en ventrikel dilatatie karakteriseren de chronische fase. Uitgebreide herinrichting van de linker hartkamer geleidelijk leidt tot ernstig hartfalen 2.
MI geïnduceerd door permanente linker anterior afdalende arterie (LAD) geeft ligatie standaard knaagdiermodel van chronische myocardiaal infarct. De coronaire ligatuur bootst de coronaire occlusie. De grootte van het infarct afhankelijk van de plaats van de ligatuur. Karakterisering van ischemische verwonding in een knaagdier model is klassiek uitgevoerd met behulp van biomarker plasma niveaus, zoals troponine I en T 3, echocardiografie, MRI en histologie 4,5. Biomarker niveaus zijn gecorreleerd met de mate van cardiomyocyten dood. Echocardiografie beoordeelt de linker ventrikel functie impairment die door de regionale wandbeweging afwijkingen. Bovendien, niet-invasieve beeldvormingstechnieken, zoals MRI of hoge resolutieechocardiografie, laat de beoordeling van de vermindering van de wandbeweging, het volume van het litteken met verminderde perfusie en levensvatbaar myocardium en de wandverdunning. LV bouwvorm maken een nauwkeurige beoordeling van infarctgrootte. Tenslotte kan de kwantificering van levensvatbare en dode myocardium worden uitgevoerd postmortem gebruikmaking van specifieke vlekken van histologische secties van geoogste hart en maakt controle van de infarctgrootte (IS). Een ander belangrijk kenmerk is de evaluatie van het infarct expansie-index (EI) 6. De EI wordt geassocieerd met de transmurale infarct en begint binnen de eerste 3 dagen. De EI wordt gekenmerkt door een geleidelijke vermindering van de wanddikte, een verhoging van de LV holtegrootte, en veranderingen in LV vorm.
Om de therapeutische werkzaamheid van nieuwe behandelingen te evalueren – in het bijzonder, de regeneratieve strategieën op basis van cellen, matrices en genafgifte-nauwkeurige vaststelling van de MI bij knaagdieren is van het allergrootste belang.Gemeten over een dwarsdoorsnede verkrijgen op de papillaire spier niveau, kan de grootte is vertekend door de grote variabiliteit in infarct ontwikkeling bestaat na LAD ligatie; de apex infarct kan dan worden afgedekt. Belangrijk is dat nauwkeuriger methodologieën bepaald MI maat beschreven voor muizen of ratten 7-9 10. Toch is onvoldoende is om nauwkeurig te kwantificeren LV remodeling of therapeutisch geïnduceerde reducties (of ziektes te voorkomen) van de verbouwing. Inderdaad, wordt gewoonlijk uitgedrukt als percentage van de totale LV volume beoordeeld op dwarsdoorsneden van het hart. Hoewel deze methode geldt voor acuut MI, het dunner worden van de LV wand optreedt tijdens verbouwing blijft onder geëvalueerd 11,12. Een volledige morfometrische kwantificatie van infarctgrootte en structurele veranderingen moeten verschillende parameters, zoals endocardiale en epicardiale lengtes en diameters, en infarct en gezonde gebieden te kwantificeren. We beschrijven een methodologisch ca.oach om nauwkeurig te beoordelen MI en verbouwing in een chronische rat model.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Fibrotisch weefsel kan nauwkeurig worden bepaald in een chronische MI rat model met behulp van een systematische bemonstering van de geoogste hart en het imago analyses van trichromatische-gekleurde histologische secties verkregen van basis tot apex. Twee stappen zijn vooral van belang voor een succesvolle implementatie protocol. Ten eerste, het gebruik van KCl voor hart oogsten kan de hartspier in een ontspannen toestand worden gehandhaafd….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The study was supported by the Swiss National Foundation [SNF 310030-149986 to MNG], the University of Fribourg, and Fribourg Hospital.
Materials
| Acrylic rat heart matrix 2mm | 72-5015 | Harvard Appartus | |
| INSPIRA ADVANCED VOLUME CONTROLLED VENTILATOR | HARVARD APPARATUS | 557058 | |
| CATHETER INSYTE 14G | BD | 381267 | |
| O.C.T | BDHA361603E | VWR | |
| TTC | T8877-10G | Sigma Aldrich | |
| Mayer hematoxylin | MHS32-1L | Sigma Aldrich | |
| Acid Fuchsin CI 42685 |
F8129-50G | Sigma Aldrich | |
| Ponceau Xylidin CI 16150 |
P2395-25G | Sigma Aldrich | |
| Orange G CI 16230 |
O3756-100G | Sigma Aldrich | |
| Light green CI 42095 |
L5382-25G | Sigma Aldrich | |
| KCl | P9333-500G | Sigma Aldrich | |
| Xylol | 10315083 | HoneyWell | |
| Ethanol absolute | 10303990 | HoneyWell | |
| 2-methylbutane | M32631-1L | Sigma Aldrich | |
| Stereogical microscope | SM2800 | Nikon | |
| Formaldehyde | 99340 | Reactolab | |
| Embedding cassette | K113.1 | Carl Roth | |
| Bersoft Image measurement Software | Bersoft.com | Licensed software |
Riferimenti
- Amsterdam, E. A., et al. AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 64, e139-e228 (2014).
- Konstam, M. A., Kramer, D. G., Patel, A. R., Maron, M. S., Udelson, J. E. Left ventricular remodeling in heart failure: current concepts in clinical significance and assessment. JACC Cardiovasc Imaging. 4, 98-108 (2011).
- Frobert, A., et al. Prognostic Value of Troponin I for Infarct Size to Improve Preclinical Myocardial Infarction Small Animal Models. Front Physiol. 6, 353 (2015).
- Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17, 268-272 (2012).
- Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, 2996-3006 (2014).
- Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117, 1388-1396 (2008).
- Valente, M., et al. Optimized heart sampling and systematic evaluation of cardiac therapies inmouse models of ischemic injury: Assessment of cardiacremodeling and semi-automated quantification of myocardial infarctsize. Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 359-391 (2015).
- Csonka, C., et al. Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 163-170 (2010).
- Zornoff, L. A., Paiva, S. A., Minicucci, M. F., Spadaro, J. Experimental myocardium infarction in rats: Analysis of the model. Arq. Bras Cardiol. 93, 434-440 (2009).
- Lichtenauer, M., et al. Myocardial infarct size measurement using geometric angle calculation. Eur J Clin Invest. 44, 160-167 (2014).
- Lutgens, E., et al. Chronic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes. Cardiovasc Res. 41, 586-593 (1999).
- Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, L., Giraud, M. N. Cell-based therapy for heart failure in rat: double thoracotomy for myocardial infarction and epicardial implantation of cells and biomatrix. J Vis Exp. , e51390 (2014).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. J Appl Physiol (1985). 102, 2104-2111 (2007).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101, 593-600 (1981).
- Weisman, H. F., Bush, D. E., Mannisi, J. A., Weisfeldt, M. L., Healy, B. Cellular mechanisms of myocardial infarct expansion. Circulation. 78, 186-201 (1988).
- Mannisi, J. A., Weisman, H. F., Bush, D. E., Dudeck, P., Healy, B. Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat. J Clin Invest. 79, 1431-1439 (1987).
