Quantificação histológico de miocárdio crônico infarto em ratos

Summary

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

Abstract

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

Introduction

O infarto do miocárdio (MI) é uma das principais causas de morte e incapacidade em todo o mundo. A doença cardíaca coronária é a causa principal; MI resulta de isquemia consecutiva a eventos coronarianos, como a oclusão. Quando reperfusão não é realizada dentro do primeiro 6 horas, isquemia induz necrose miocárdica irreversível. Em pacientes, o caracterização de MI conta com diferentes ferramentas de diagnóstico, incluindo sinais clínicos, eletrocardiograma, avaliação dos níveis plasmáticos de biomarcadores, ecocardiograma, imagiologia de ressonância magnética, e histológica ^1. MI aguda e crónica são classificados como duas fases diferentes da lesão de acordo com a temporização da necrose do miocárdio em relação ao momento da oclusão coronária. A fase aguda, ocorrendo durante os primeiros 7 dias, está associada com a perda de cardiomiócitos, inflamação extensiva, e o recrutamento de fibroblastos. A fase sub-aguda, caracterizada por a cura do tecido cardíaco e a formação de uma cicatriz, ocorreentre 1 e 4 – 6 semanas. Expansão do infarto, afinamento da parede do ventrículo, e dilatação do ventrículo caracterizar a fase crônica. Remodelação extensa do ventrículo esquerdo resulta progressivamente de insuficiência cardíaca grave ^2.

MI induzida pelo permanente anterior esquerda artéria descendente (LAD) ligadura representa o modelo de roedor padrão de infarto crônico do miocárdio. Os imita ligadura coronária oclusão coronária. O tamanho do enfarte depende do local da ligadura. Caracterização de lesão isquémica do miocárdio em um modelo de roedor é classicamente realizada utilizando os níveis plasmáticos de biomarcadores, como a troponina I e T ^3, ecocardiograma, ressonância magnética, e histologia ^4,5. níveis de biomarcadores são correlacionados com a extensão da morte de cardiomiócitos. Ecocardiografia avalia a esquerda comprometimento da função ventricular resultante de anormalidades de movimento de parede regional. Além disso, técnicas de imagem não invasivos, como a ressonância magnética ou de alta resoluçãoecocardiografia, permitir a avaliação da redução do movimento da parede, o volume da área da cicatriz com diminuição da perfusão e miocárdio viável, eo afinamento da parede. dimensões do VE permitir a avaliação precisa do tamanho do infarto. Finalmente, a quantificação do miocárdio viável e mortos podem ser post-mortem realizados usando manchas específicas de secções histológicas de corações colhidas e permite a verificação do tamanho do enfarte (IS). Outra característica importante é a avaliação do índice de expansão do enfarte (EI) ^6. A EI é associado com o infarto transmural e começa nos primeiros 3 dias. A EI é caracterizada por uma redução progressiva da espessura da parede, um aumento no tamanho da cavidade do VE, e consequentes alterações na forma do LV.

A fim de avaliar a eficácia terapêutica de novos tratamentos – em particular, as estratégias baseadas em células regenerativas, matrizes, e o gene de avaliação de entrega precisas de MI em roedores é de importância primordial.Quando medido em uma única seção transversal obtida ao nível dos músculos papilares, o tamanho é pode ser tendenciosa, devido à grande variabilidade que existe no desenvolvimento do infarto seguinte ligadura LAD; o enfarte apex pode ser, em seguida, ocultado. Importante, as metodologias mais precisas para o tamanho determinado MI têm sido descritos para ratinhos ou ratos ^{7-9 10.} No entanto, é insuficiente para quantificar com precisão remodelação LV ou reduções induzidas terapeuticamente (ou prevenções) da remodelação. Com efeito, este modo é geralmente expressa como uma percentagem do volume total do VE avaliada em secções transversais do coração. Embora este método é válido para infarto agudo do miocárdio, o afinamento da parede do LV que ocorre durante a remodelação permanece sub-avaliada ^11,12. A quantificação morfométrica completa do tamanho do infarto e mudanças estruturais devem quantificar vários parâmetros, tais como comprimentos do endocárdio e epicárdio e diâmetros, bem como enfarte e áreas saudáveis. Nós descrevemos um aprox metodológicaoach para avaliar com precisão MI e remodelação em um modelo de rato crônica.

Protocol

Todos os animais receberam cuidados de acordo com a Convenção Europeia dos Animal Care. Os procedimentos cirúrgicos foram realizados em conformidade com a Lei de Protecção dos Animais Suíça depois de obter autorização do Serviço Veterinário do Estado, Fribourg, aprovado pelo Swiss Federal Veterinário, Suíça. Colheita 1. Coração NOTA: Todas as intervenções cirúrgicas foram realizadas sob anestesia isoflurano. Foram feitos esforços para diminuir o…

Representative Results

pós-LAD ligadura seis semanas, corações foram colhidas de ratos Lewis. secções de tecido de 2 mm foram obtidas a partir do vértice para a base. Um procedimento de coloração TTC foi realizada para visualizar a área de enfarte, que aparece em branco, eo miocárdio saudável, que aparece em vermelho (Figura 2). Dependendo do local de ligação da ADA, a dimensão do enfarte varia. Para grande MI, infartos transmurais foram observados a partir do vértice para a bas…

Discussion

Passos críticos dentro do Protocolo

tecido fibrótico pode ser avaliada com precisão em um modelo de rato MI crónica utilizando amostragem sistemática do coração e imagem colhida análises dos cortes histológicos tricromáticas-manchado obtidos a partir da base para o ápice. Dois passos são particularmente importantes para implementação do protocolo de sucesso. Em primeiro lugar, o uso de KCl para a colheita coração permite que o músculo cardíaco a ser mantido…

Materials

Acrylic rat heart matrix 2mm	72-5015	Harvard Appartus
INSPIRA ADVANCED VOLUME CONTROLLED VENTILATOR	HARVARD APPARATUS	557058
CATHETER INSYTE 14G	BD	381267
O.C.T	BDHA361603E	VWR
TTC	T8877-10G	Sigma Aldrich
Mayer hematoxylin	MHS32-1L	Sigma Aldrich
Acid Fuchsin CI 42685	F8129-50G	Sigma Aldrich
Ponceau Xylidin CI 16150	P2395-25G	Sigma Aldrich
Orange G CI 16230	O3756-100G	Sigma Aldrich
Light green CI 42095	L5382-25G	Sigma Aldrich
KCl	P9333-500G	Sigma Aldrich
Xylol	10315083	HoneyWell
Ethanol absolute	10303990	HoneyWell
2-methylbutane	M32631-1L	Sigma Aldrich
Stereogical microscope	SM2800	Nikon
Formaldehyde	99340	Reactolab
Embedding cassette	K113.1	Carl Roth
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