Histologisk Kvantifiering av kronisk hjärtinfarkt hos råttor

Summary

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

Abstract

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

Introduction

Hjärtinfarkt (MI) är en ledande orsak till död och handikapp i hela världen. Kranskärlssjukdom är den främsta orsaken; MI resultat från ischemi i rad till koronara händelser såsom ocklusion. När reperfusion inte utförs inom de första 6 h inducerar ischemi irreversibel myokardnekros. Hos patienter, karakterisering av MI är beroende av olika diagnosverktyg, inklusive kliniska tecken, EKG, utvärdering av plasmanivåerna av biomarkörer, ekokardiografi, MRI, och histologiska analyser ^1. Akut och kronisk Ml klassificeras som två olika faser av skada beroende på tidpunkten för myokardnekros förhållande till tiden för den koronara ocklusionen. Den akuta fasen, som inträffar under de första 7 dagarna, är förknippad med förlust av hjärtmuskelceller, omfattande inflammation, och rekryteringen av fibroblaster. Den subakuta fasen, som kännetecknas av läkning av hjärtvävnaden och bildandet av ett ärr, uppstårmellan 1 och 4 – 6 veckor. Utbyggnad av infarkt, ventrikeln vägg gallring, och kammare dilatation karakterisera den kroniska fasen. Omfattande ombyggnad av den vänstra kammaren resulterar successivt i svår hjärtsvikt ^2.

MI inducerad av permanent vänstra främre nedåtgående artär (LAD) ligering representerar standard gnagare modell av kronisk hjärtinfarkt. Krans ligatur härmar koronar ocklusion. Storleken på infarkt beror på platsen för ligatur. Karakterisering av myokardiell ischemisk skada i en gnagarmodell är klassiskt utfördes med användning av biomarkörer plasmanivåer, såsom troponin I och T ^3, ekokardiografi, MRI, och histologi ^4,5. Biomarkörer nivåer är korrelerade med graden av cardiomyocyte död. Ekokardiografi utvärderar vänsterkammarfunktion till följd av regionala vägg rörelse avvikelser. Dessutom icke-invasiva avbildningstekniker, såsom MRI eller hög upplösningekokardiografi, att en bedömning av minskningen av väggrörelsen, volymen av ärr med minskad perfusion och livskraftiga hjärtmuskeln, och väggen gallring. LV dimensioner tillåta noggrann utvärdering av infarktstorlek. Slutligen kan utföras kvantifiering av livsdugliga och döda hjärtmuskeln obduktion med användning av specifika fläckar av histologiska sektioner av skördade hjärtan och tillåter kontroll av infarktstorleken (IS). En annan viktig egenskap är den utvärdering av infarktexpansionsindexet (EI) ^6. EI är associerad med transmural infarkt och startar inom de första 3 dagarna. EI kännetecknas av en gradvis minskning i väggtjocklek, en ökning av LV hålrum storlek, och därmed förändringar i LV form.

För att utvärdera den terapeutiska effekten av nya behandlingar – i synnerhet de regenerativa strategier baserade på celler, matriser och genleverans-korrekt bedömning av MI hos gnagare är av största vikt.När den mäts på ett enda tvärsnitt erhålls vid papillarmuskeln nivå, kan IS storlek vara förspänd grund av den stora variationen som finns i infarkt utveckling efter LAD ligation; apex infarkt kan sedan avskärmas. Viktigt har mer exakta metoder som skall fastställas MI storlek beskrivits för möss ^7-9 eller råttor ^10. Ändå är otillräcklig för att exakt kvantifiera LV ombyggnad eller terapeutiskt inducerade minskningar (eller preventions) av ombyggnad. I själva verket är vanligen uttryckt i procent av den totala LV volym bedömdes på tvärsnitt av hjärtat. Även om denna metod är giltig för akut hjärtinfarkt, förblir förtunning av LV väggen inträffar under ombyggnad under utvärderas ^11,12. En komplett morfometriska kvantifiering av infarktstorlek och strukturella förändringar bör kvantifiera flera parametrar, såsom endokardiella och epikardiella längder och diametrar, samt infarkt och friska områden. Vi beskriver en metod ca.oach att exakt bedöma MI och ombyggnad i en kronisk råttmodell.

Protocol

Alla djur fick human vård i enlighet med den europeiska konventionen om djuromsorg. Kirurgiska ingrepp genomfördes i enlighet med den schweiziska djurskyddslagen efter tillstånd av den statliga veterinärmyndigheten, Freiburg, som godkänts av det schweiziska schweiziska veterinärmyndigheterna, Schweiz. 1. Heart Skörd OBS: Alla kirurgiska ingrepp utfördes under isoflurananestesi. Ansträngningar gjordes för att minska djurens lidande. I synnerhet, fick alla …

Representative Results

Sex veckor efter LAD ligation, var hjärtan skördas från Lewis-råttor. 2-mm vävnadssektioner erhölls från apex till bas. En TTC färgningsproceduren utfördes för att visualisera infarktområdet, som visas i vitt, och den friska hjärtmuskeln, som visas i rött (Figur 2). Beroende på platsen för ligering av LAD, varierar infarktstorleken. För stora MI ades transmurala infarkter observeras från spetsen till basen (Figur 2A). Mindre infarkter pr…

Discussion

Kritiska steg i protokollet

Fibrotisk vävnad exakt kan bedömas i en kronisk MI råttmodell med hjälp av systematisk provtagning av den skördade hjärta och bildanalyser av trikromatiska-färgade histologiska sektioner som erhållits från basen till spetsen. Två steg är särskilt viktigt för ett framgångsrikt genomförande protokoll. För det första, användningen av KCl för hjärt skörd medger hjärtmuskeln för att bibehållas i ett avslappnat tillstånd. Detta …

Materials

Acrylic rat heart matrix 2mm	72-5015	Harvard Appartus
INSPIRA ADVANCED VOLUME CONTROLLED VENTILATOR	HARVARD APPARATUS	557058
CATHETER INSYTE 14G	BD	381267
O.C.T	BDHA361603E	VWR
TTC	T8877-10G	Sigma Aldrich
Mayer hematoxylin	MHS32-1L	Sigma Aldrich
Acid Fuchsin CI 42685	F8129-50G	Sigma Aldrich
Ponceau Xylidin CI 16150	P2395-25G	Sigma Aldrich
Orange G CI 16230	O3756-100G	Sigma Aldrich
Light green CI 42095	L5382-25G	Sigma Aldrich
KCl	P9333-500G	Sigma Aldrich
Xylol	10315083	HoneyWell
Ethanol absolute	10303990	HoneyWell
2-methylbutane	M32631-1L	Sigma Aldrich
Stereogical microscope	SM2800	Nikon
Formaldehyde	99340	Reactolab
Embedding cassette	K113.1	Carl Roth
Bersoft Image measurement Software		Bersoft.com	Licensed software