Подмороженная трансплантация островков в эпидидимальной жировой клетке диабетических мышей
Summary
Этот протокол демонстрирует изоляцию мышиного островка и посев на дезаклеарном эшафоте. Осадки, поддерживаемые эшафотом, трансплантировали в эпидидимальную жировую площадку стрептозотоцина (STZ) -индуцированных диабетических мышей. Островки выживали на участке трансплантации и меняли гипергликемическое состояние.
Abstract
Было доказано, что трансплантация островков эффективна при лечении диабета 1 типа. Тем не менее, нынешняя стратегия внутрипеченочной трансплантации может иметь острую реакцию цельной крови и приводить к плохому приживлению островков. Здесь мы сообщаем о надежном протоколе для трансплантации островков на внепеченочном участке трансплантации – эпидидимальной жировой подушке (EFP) – в модели диабетической мыши. Описан протокол для выделения и очистки островков с высоким выходом от мышей C57BL / 6J, а также метод трансплантации, выполняемый посевными островками на дезаклеарный каркас (DCS) и имплантация их на сайт EFP у сингенных мышей C57BL / 6J, которые были диабетическими Стрептозотоцином. Трансплантат DCS, содержащий 500 островков, перевернул гипергликемическое состояние в течение 10 дней, в то время как свободные островки без DCS требовали не менее 30 дней. Нормогликемия поддерживалась на срок до 3 месяцев, пока не был эксплантирован трансплантат. В заключение DCS усилило приживление островков в tОн внепеченочный сайт EFP, который можно легко получить и может обеспечить воспроизводимую и полезную платформу для исследования материалов лесов, а также другие параметры трансплантации, необходимые для успешного приживления островков.
Introduction
Сахарный диабет 1 типа (T1D) является аутоиммунным эндокринным расстройством, в котором островковые клетки удаляются иммунной системой, что делает пациентов зависимыми от инъекции экзогенного инсулина на всю жизнь. Протокол Эдмонтона представляет собой веху в клинических исследованиях трансплантации островков; Островки вводили через портальную вену и трансплантировали на внутрипеченочном участке 1 . Однако два основных препятствия – неадекватные источники островков-доноров и плохое приживление островков – препятствуют широкому успеху трансплантации островков 2 . Как правило, островки необходимо собирать у трех доноров трупы, чтобы отменить гипергликемическое состояние одного пациента; Это связано с низким выходом процедур изоляции островков и потерями островков после трансплантации. В частности, хотя островки после трансплантации были омыты богатой кислородом кровью, прямой контакт с кровью часто вызывал мгновенную опосредованную кровью инфаркта(IBMIR), что может вызвать острую потерю островков. В долгосрочной перспективе считается, что постепенная потеря островков у пациентов объясняла снижение показателей реверсии диабета в клинических группах, которые могли достичь 90% в первый год и снизились до 30% и 10% на 2 и 5 Лет после трансплантации, соответственно 3 .
Трансплантация островков на внепеченочных участках была привлекательной стратегией для уменьшения прямого контакта островков с кровью, ограничивая трансплантацию до более определяемых мест по сравнению с внутрипеченочной инфузией. В последние годы исследования были проведены в капсулах для почек, глазных мышцах, мышцах, жировых клетках и подкожных клетках, что свидетельствует о том, что островки на этих участках способны выжить и функционировать для восстановления нормогликемии 4 . Кроме того, островки на этих участках извлекаются, что позволяет проводить биопсию или даже для дальнейших процедур замены. ВнепеченочныеПоэтому он демонстрирует большой потенциал для клинической трансплантации 5 .
Исследования на основе биоматериалов интенсивно изучались для трансплантации клеток и тканевой инженерии. Трехмерные (3D) леса обычно содержат пористые структуры и могут служить в качестве клеточных шаблонов для создания пространственной структуры / организации клеток или в качестве резервуаров для обеспечения контролируемого высвобождения биоактивных сигналов. Леса также были изготовлены из полимерных материалов, таких как поли (гликолид-L-лактид) 6 , поли (диметилсилоксана) 7 и термопластичный поли (уретан) 8 , в трансплантационные островки в EFP. Было обнаружено, что по сравнению с прямой трансплантацией островков было обнаружено, что использование подмостей уменьшает потери островков, предотвращая утечку островков во внутрибрюшинную полость 9 , 10 , обеспечивая механическую защиту и модулюЛокализуя местную воспалительную реакцию. Таким образом, строительные леса могут быть разработаны для содействия приживлению островков на участках трансплантации 7 .
В этом исследовании мы намерены продемонстрировать парадигму трансплантации островков в EFP, проводимую в моделях мышей с использованием DCS. Леса, полученные из внеклеточных матриц, в последние годы вызвали большой интерес благодаря превосходной биосовместимости и более естественным пористым структурам по сравнению с синтетическими продуктами. Здесь мы описываем надежный протокол изоляции для получения островков поджелудочной железы с высоким выходом у мышей C57BL / 6J. DCS, обработанные из бычьего перикарда, затем засевали островками, и трансплантаты были трансплантированы в EFP в сингенных диабетических моделях. Нормогликемия у мышей была достигнута в течение 10 дней и поддерживалась до 100 дней до удаления трансплантатов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Перфузия поджелудочной железы и время переваривания являются двумя ключевыми параметрами, которые влияют на выход и качество остэка. Moskalewski впервые сообщило об использовании сырой смеси коллагеназы для переваривания поджелудочной железы поджелудочной железы морской свинки <sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Вэй Чжан из Guanhao Biotech за предоставление декоративных лесов. Мы благодарим Сяо-хон Пэн за полезные обсуждения. Это исследование было финансово поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (проект №31322021).
Materials
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
Riferimenti
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
