Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos
Summary
Este protocolo demuestra el aislamiento de los islotes murinos y la siembra en un andamio decelularizado. Los islotes soportados por el andamio fueron trasplantados en la almohadilla de grasa epididimal de ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ). Los islotes sobrevivieron en el sitio del trasplante e invirtieron la condición hiperglucémica.
Abstract
El trasplante de islotes ha demostrado clínicamente ser eficaz en el tratamiento de la diabetes tipo 1. Sin embargo, la actual estrategia de trasplante intrahepático puede incurrir en reacciones agudas de sangre entera y resultar en inseminación de islotes pobres. En este trabajo se presenta un protocolo robusto para el trasplante de islotes en el sitio de trasplante extrahepático -la almohadilla de grasa epididimal (EFP) – en un modelo de ratón diabético. Se describe un protocolo para aislar y purificar islotes con altos rendimientos de ratones C57BL / 6J, así como un método de trasplante realizado mediante la siembra de islotes sobre un andamio decelularizado (DCS) y su implantación en el sitio EFP en ratones C57BL / 6J singénicos rendidos diabéticos Por la estreptozotocina. El injerto DCS que contenía 500 islotes invirtió la condición hiperglucémica en 10 días, mientras que los islotes libres sin DCS requirieron al menos 30 días. La normoglucemia se mantuvo hasta 3 meses hasta que se explantó el injerto. En conclusión, DCS mejoró el injerto de islotes en tEl sitio extrahepático de la EFP, que podría ser fácilmente recuperado y podría proporcionar una plataforma reproducible y útil para investigar los materiales del andamio, así como otros parámetros de trasplante requeridos para un inseminación exitosa de islotes.
Introduction
La diabetes mellitus tipo 1 (T1D) es un trastorno endocrino autoinmune en el que las células de los islotes son ablacionadas por el sistema inmunitario, haciendo que los pacientes dependan de la inyección de insulina exógena durante toda su vida. El protocolo de Edmonton representa un hito en los estudios clínicos del trasplante de islotes; Los islotes fueron infundidos a través de la vena porta y trasplantados en el sitio intrahepático [ 1] . Sin embargo, dos obstáculos principales-fuentes inadecuadas de islotes donantes y insectos de islotes pobres-impiden el gran éxito del trasplante de islotes 2 . Por lo general, los islotes necesitan ser recogidos de tres donantes cadáveres para revertir la condición hiperglucémica de un paciente; Esto se debe al bajo rendimiento de los procedimientos de aislamiento de islotes ya la pérdida de islotes tras el trasplante. En particular, aunque los islotes posteriores al trasplante se bañaban en sangre rica en oxígeno, el contacto directo con la sangre evocaba a menudo la inflamación mediada por la sangre instantánea(IBMIR), que podría causar la pérdida aguda de los islotes. A largo plazo, se piensa que la pérdida gradual de islotes en los pacientes explicó la caída de las tasas de reversión de la diabetes en los grupos clínicos, que podría llegar al 90% en el primer año y disminuir a 30% y 10% a 2 y 5 Años después del trasplante, respectivamente 3 .
El trasplante de islote en los sitios extrahepáticos ha sido una estrategia atractiva para reducir el contacto directo de los islotes con la sangre mientras se confina los trasplantes a lugares más definibles en comparación con la infusión intrahepática. Se han realizado estudios en la cápsula renal, ojos, músculos, almohadillas de grasa y espacios subcutáneos en los últimos años, mostrando que los islotes en estos sitios son capaces de sobrevivir y funcionan para restaurar la normoglucemia 4 . Además, los islotes en estos sitios son recuperables, lo que hace posible la biopsia o incluso para procedimientos de reemplazo adicionales. ExtrahepáticoItes por lo tanto, muestran un gran potencial para el trasplante clínico [ 5] .
Los andamios basados en biomateriales han sido intensamente investigados para el trasplante de células y la ingeniería de tejidos. Los andamios tridimensionales (3D) generalmente contienen estructuras porosas y pueden servir como plantillas celulares para generar estructura espacial / organización de células o como reservorios para proporcionar la liberación controlada de señales bioactivas. Los andamios también se han fabricado a partir de materiales poliméricos, tales como poli (glicolida-L-lactida) 6 , poli (dimetilsiloxano) 7 y poli (uretano) termoplástico 8 , para transplantar islotes en la EFP. En comparación con el trasplante directo de islotes, se encontró que el uso de andamios reduce la pérdida de islotes al prevenir la fuga de islotes en la cavidad intraperitoneal 9 , 10 , proporcionando protección mecánica y moduLa reacción inflamatoria local. Los andamios pueden así desarrollarse para promover el injerto de islotes en los sitios de trasplante 7 .
En este estudio, pretendemos demostrar un paradigma de trasplante de islotes en la EFP, llevado a cabo en modelos de ratones utilizando un DCS. Los andamios derivados de matrices extracelulares han atraído gran interés en los últimos años debido a la biocompatibilidad superior ya estructuras naturales porosas más comparadas con productos sintéticos. Aquí, describimos un robusto protocolo de aislamiento para obtener los islotes pancreáticos con altos rendimientos de ratones C57BL / 6J. Los DCSs procesados a partir del pericardio bovino fueron entonces sembrados con islotes, y los injertos fueron trasplantados a la EFP en modelos diabéticos singénicos. La normoglucemia en ratones se logró en 10 días y se mantuvo hasta 100 días, hasta la eliminación de los injertos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La perfusión del páncreas y el tiempo de digestión son dos parámetros clave que afectan el rendimiento y la calidad de los islotes. Moskalewski informó por primera vez el uso de una mezcla de colagenasa cruda para digerir el páncreas de conejillo de indias picada [ 11] . Lacy et al. Informó la inyección de enzimas en el sistema de conductos para perfundir el páncreas, lo que aumentó considerablemente el rendimiento de islotes [ 12]</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Wei Zhang de Guanhao Biotech por proporcionar los andamios decelularizados. Damos las gracias a Xiao-hong Peng por las discusiones útiles. Esta investigación fue apoyada financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Proyecto No.31322021).
Materials
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
Riferimenti
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