Stillads-understøttet transplantation af islænder i epididymisk fedtpude af diabetiske mus
Summary
Denne protokol demonstrerer murin islet isolering og såning på en decellulariseret stillads. Stilladsunderstøttede øer blev transplanteret i den epididymiske fedtpude af streptozotocin (STZ) -inducerede diabetiske mus. Islets overlevede på transplantationsstedet og reverserede den hyperglykæmiske tilstand.
Abstract
Isletransplantation er klinisk bevist at være effektiv til behandling af type 1 diabetes. Imidlertid kan den nuværende intrahepatiske transplantationsstrategi medføre akutte helblodsreaktioner og resultere i fattig islet engraftment. Her rapporterer vi en robust protokol til transplantation af øer på det ekstrahepatiske transplantationssted – den epididymale fedtopat (EFP) – i en diabetisk musemodel. En protokol til isolering og oprensning af øer ved høje udbytter fra C57BL / 6J mus er beskrevet, såvel som en transplantationsmetode udført af seedøer på et decellulariseret stillads (DCS) og implantering dem på EFP-stedet i syngene C57BL / 6J mus-renderede diabetiske Af streptozotocin. DCS-transplantatet indeholdende 500 øer reverserede den hyperglykæmiske tilstand inden for 10 dage, mens de frie øer uden DCS krævede mindst 30 dage. Normoglykæmi blev opretholdt i op til 3 måneder, indtil graften blev eksplanteret. Som konklusion forbedrede DCS engraftment of islets into tHan ekstrahepatiske site af EFP, som let kunne hentes og muligvis tilvejebringe en reproducerbar og nyttig platform til undersøgelse af stilladsmaterialerne, såvel som andre transplantationsparametre, der kræves for en vellykket holning.
Introduction
Type 1 diabetes mellitus (T1D) er en autoimmun endokrine lidelse, hvor ølceller ablateres af immunsystemet, hvilket gør patienterne afhængige af injektion af eksogent insulin i hele deres liv. Edmonton-protokollen repræsenterer en milepæl i kliniske undersøgelser af øletransplantation; Øer blev infunderet gennem portalvenen og transplanteret på det intrahepatiske sted 1 . Imidlertid forhindrer to store hindringer – utilstrækkelige kilder til donorøer og fattig øl-indflydelse – den store succes med øletransplantationen 2 . Øer skal normalt indsamles fra tre cadaveriske donorer for at reversere den hyperglykæmiske tilstand hos en patient; Dette skyldes det lave udbytte af ølisoleringsprocedurer og øletab efter transplantation. I særdeleshed fremkaldte den direkte kontakt med blod ofte det øjeblikkelige blodmedierede inflamma, selv om post-transplantationsøerne blev badet i oxygenholdigt blod.Tory reaktion (IBMIR), hvilket kunne forårsage akut tab af øerne. På lang sigt antages det, at det gradvise tab af øer hos patienter tegnede sig for faldet i tilbagegang i diabetes i de kliniske grupper, som kunne nå 90% i det første år og faldt til 30% og 10% med 2 og 5 År efter transplantation henholdsvis 3 .
Isletransplantation på ekstrahepatiske steder har været en attraktiv strategi for at reducere direkte kontakt mellem øer med blod og begrænsning af transplantaterne til mere definerbare steder sammenlignet med intrahepatisk infusion. Undersøgelser er blevet gennemført i nyrekapsel, øje, muskler, fedtpuder og subkutane rum de seneste år, hvilket viser at øer på disse steder er i stand til at overleve og fungere for at genoprette normoglykæmi 4 . Derudover er øerne på disse steder retrievable, hvilket gør det muligt for biopsi eller endda til yderligere udskiftningsprocedurer. Extrahepatic sDet viser derfor stort potentiale for klinisk transplantation 5 .
Biomaterialebaserede stilladser er blevet undersøgt intensivt for celletransplantation og vævsteknik. Tredimensionale (3D) stilladser indeholder sædvanligvis porøse strukturer og kan tjene som cellulære skabeloner til at generere rumlig struktur / organisering af celler eller som reservoirer for at tilvejebringe den styrede frigivelse af bioaktive signaler. Stilladser er også blevet fremstillet af polymere materialer, såsom poly (glycolid-L-lactid) 6 , poly (dimethylsiloxan) 7 og termoplastisk poly (urethan) 8 til transplantationsøer i EFP. Sammenlignet med den direkte transplantation af øer viste brugen af stilladser at reducere øltab ved at forhindre lækage af øer i det intraperitoneale hulrum 9 , 10 , hvilket gav mekanisk beskyttelse og moduLating den lokale inflammatoriske reaktion. Stilladserne kan således udvikles for at fremme øl-engraftment på transplantationsstederne 7 .
I denne undersøgelse har vi til hensigt at demonstrere et paradigme af øletransplantation i EFP, udført i musmodeller ved hjælp af en DCS. Stilladser afledt af ekstracellulære matricer har tiltrukket stor interesse i de seneste år på grund af den overlegne biokompatibilitet og mere naturlige porøse strukturer sammenlignet med syntetiske produkter. Her beskriver vi en robust isolationsprotokol for at opnå pancreasøer med høje udbytter fra C57BL / 6J mus. DCS'er behandlet fra bovin perikardiet blev derefter podet med øer, og transplantaterne blev transplanteret til EFP i syngene diabetiske modeller. Normoglykæmi hos mus blev opnået inden for 10 dage og blev opretholdt i op til 100 dage indtil fjernelsen af transplantaterne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pancreas perfusion og fordøjelsestid er to vigtige parametre, der påvirker islet udbytte og kvalitet. Moskalewski rapporterede for første gang brugen af en rå collagenaseblanding til fordøjelse af hakket marsvinpancreas 11 . Lacy et al. Rapporterede injektionen af enzymer i kanalsystemet for at perfusere bugspytkirtlen, hvilket i høj grad øgede øludbyttet 12 . Den duale perfusion af enzym muliggør maksimal eksponering af bugspytkirtlenes overf…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Wei Zhang fra Guanhao Biotech for at levere de decellulariserede stilladser. Vi takker Xiao-hong Peng for de nyttige diskussioner. Denne forskning blev finansielt støttet af National Natural Science Foundation of China (Projekt nr. 31322021).
Materials
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
Riferimenti
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
