Byggnadsstödd transplantation av islen i epididymisk fettmatta av diabetiska möss
Summary
Detta protokoll demonstrerar murinisolisolering och sådd på en decellulariserad byggnadsställning. Ställstödda öar transplanterades i den epididymala fettkudden av streptozotocin (STZ) -inducerade diabetiska möss. Islets överlevde vid transplantationsstället och reverserade hyperglykemiska tillståndet.
Abstract
Isletransplantation har kliniskt visat sig vara effektiv vid behandling av typ 1-diabetes. Den nuvarande intrahepatiska transplantationsstrategin kan emellertid medföra akuta helblodsreaktioner och resultera i dålig engagemang av öl. Här rapporterar vi ett robust protokoll för transplantation av öar på den extrahepatiska transplantationsstället – den epididymala fettkudden (EFP) – i en diabetisk musmodell. Ett protokoll för isolering och renning av öar med höga utbyten från C57BL / 6J möss beskrivs, såväl som en transplantationsmetod som utförs genom såddöppningar på en decellulariserad ställning (DCS) och implanterar dem vid EFP-stället i syngeniska C57BL / 6J möss gjorda diabetiker Av streptozotocin. DCS-transplantatet innehållande 500 öar reverserade det hyperglykemiska tillståndet inom 10 dagar, medan de fria öarna utan DCS krävde minst 30 dagar. Normoglykemi upprätthölls i upp till 3 månader tills transplantatet eksplanterades. Sammanfattningsvis ökade DCS engagemanget av öar i tHan extrahepatiska platsen för EFP, som lätt kan hämtas och kan ge en reproducerbar och användbar plattform för undersökning av byggnadsmaterialet, liksom andra transplantationsparametrar som krävs för en framgångsrik islet-ingrepp.
Introduction
Typ 1 diabetes mellitus (T1D) är en autoimmun endokrin störning där isceller ableras av immunsystemet, vilket gör patienterna beroende av injektion av exogent insulin under hela sitt liv. Edmonton-protokollet utgör en milstolpe i kliniska studier av öletransplantation; Öar infunderades genom portvenen och transplanterades på den intrahepatiska platsen 1 . Dock är två stora hinder – otillräckliga källor till donoröar och fattig öl-engagemang – förhindra den stora framgången med öletransplantationen 2 . Vanligtvis måste holmar samlas in från tre kadaveriska givare för att reversera det hyperglykemiska tillståndet hos en patient; Detta beror på det låga utbytet av isoleringsprocedurer och ölförlusten efter transplantation. I synnerhet, även om post-transplantationsöarna badades i syrerikt blod, framkallade den direkta kontakten med blod ofta det ögonblickliga blodmedierade inflammaTory-reaktion (IBMIR), vilket kan orsaka den akuta förlusten av öarna. På lång sikt anses det att den gradvisa förlusten av öar hos patienter stod för minskningen av diabetesomvandlingshastigheter i de kliniska grupperna, vilket kan nå 90% under det första året och minskat till 30% och 10% med 2 och 5 År efter transplantation respektive 3 .
Isletransplantation på extrahepatiska ställen har varit en attraktiv strategi för att minska direktkontakt av öar med blod samtidigt som transplantationerna begränsas till mer definierbara platser jämfört med intrahepatisk infusion. Studier har utförts i njurkapsel-, ögon-, muskel-, fettkuddar och subkutana utrymmen under de senaste åren, vilket visar att öar på dessa platser kan överleva och fungera för att återställa normoglykemi 4 . Dessutom är öarna på dessa platser återvinningsbara, vilket gör det möjligt för biopsi eller till och med för ytterligare ersättningsförfaranden. Extrahepatic sDet visar därför stor potential för klinisk transplantation 5 .
Biomaterialbaserade byggnadsställningar har undersökts intensivt för celltransplantation och vävnadsteknik. Tredimensionella (3D) byggnadsställningar innehåller vanligtvis porösa strukturer och kan fungera som cellulära mallar för att generera rumslig struktur / organisering av celler eller som reservoarer för att ge det kontrollerade frigivandet av bioaktiva signaler. Ställen har också tillverkats av polymera material, såsom poly (glykolid-L-laktid) 6 , poly (dimetylsiloxan) 7 och termoplastisk poly (uretan) 8 , till transplantationsöar i EFP. Jämfört med den direkta transplanteringen av öar befanns användning av byggnadsställningar minska minskningen av islet genom att förhindra läckage av öar i den intraperitoneala kaviteten 9 , 10 , vilket gav mekaniskt skydd och moduLating den lokala inflammatoriska reaktionen. Byggnadsställena kan sålunda utvecklas för att befrämja islet-ingrepp vid transplantationsställena 7 .
I denna studie avser vi att visa ett paradigm för öletransplantation i EFP, utförd i mössmodeller med hjälp av en DCS. Byggnadsställningar som härrör från extracellulära matriser har drabbat stort intresse de senaste åren tack vare överlägsen biokompatibilitet och mer naturliga porösa strukturer jämfört med syntetiska produkter. Här beskriver vi ett robust isolationsprotokoll för att erhålla pankreatiska öar med höga utbyten från C57BL / 6J möss. DCSs bearbetade från bovin perikardium såddes sedan med öar och transplantaten transplanterades till EFP i syngeniska diabetiska modeller. Normoglykemi hos möss uppnåddes inom 10 dagar och bibehölls i upp till 100 dagar tills borttagning av transplantaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bukspottkörtelperfusion och matsmältningstid är två viktiga parametrar som påverkar hålutbytet och kvaliteten. Moskalewski rapporterade först användningen av en rå kollagenasblandning för att smälta malet marsvinpankreas 11 . Lacy et al. Rapporterade injektionen av enzymer i kanalsystemet för att perfekta bukspottkörteln, vilket kraftigt ökade utbytet 12 . Den duktala perfusionen av enzym möjliggör maximal exponering av bukspottkörtelns yta till e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Wei Zhang från Guanhao Biotech för att tillhandahålla decellulariserade byggnadsställningar. Vi tackar Xiao-hong Peng för de hjälpsamma diskussionerna. Denna forskning finansierades ekonomiskt av National Natural Science Foundation of China (Projekt nr.31322021).
Materials
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
Riferimenti
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
