JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Published: December 27, 2016
doi:
10.3791/55001
, , , , , , , , , , , ,
1UMR8576, CNRS,Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS,Lille University

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

Een van de belangrijkste uitdagingen van de gezondheidszorg in de 21e eeuw zijn neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD). Tau is een microtubule-geassocieerde eiwit dat microtubulusvorming (MT) stimuleert. Tau is eveneens betrokken bij verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, zogenaamde tauopathieën, waarvan de bekendste is AD. In deze aandoeningen, is Tau self-aggregaten in gepaarde spiraalvormige filamenten (PHF) en vond gewijzigd op vele residuen door posttranslationele modificaties (PTMs), zoals fosforylering 1. Fosforylering van tau-eiwit is betrokken bij zowel de regulering van de fysiologische functie van MT stabilisatie en pathologische verlies van functie die AD neuronen kenmerkt.

Bovendien Tau eiwit, indien geïntegreerd in PHF's bij zieke neuronen, onveranderlijk hypergefosforyleerd 2. In tegenstelling tot normale Tau dat 2-3 fosfaatgroepen bevat, de hypergefosforyleerde Tau in PHF's bevat 5-9 Phosphate 3 groepen. Hyperfosforylering van Tau overeen zowel met een stijging van stoichiometrie bij sommige sites en fosforylering van extra sites die pathologische plaatsen van fosforylering worden genoemd. Er bestaat echter overlapping tussen AD en normale volwassen patronen van fosforylering, ondanks kwantitatieve verschillen in het niveau 4. Hoe specifiek fosforylering gebeurtenissen invloed functie en disfunctie van Tau blijft grotendeels onbekend. Wij streven ernaar om Tau regelgeving ontcijferen door PTMs op moleculair niveau.

Om het begrip van de moleculaire aspecten van Tau verdiepen, we moeten technische uitdagingen aan te pakken. Ten eerste, Tau is een intrinsiek ongeordend eiwit (IDP) als geïsoleerd in oplossing. Dergelijke eiwitten missen welomschreven driedimensionale structuur onder fysiologische omstandigheden en vereisen specifieke biofysische methoden om hun functie (s) en structurele eigenschappen te bestuderen. Tau is een paradigma voor de groeiende klasse van ontheemden, vaak geassocieerd metaandoeningen zoals neurodegeneratieve ziekten, vandaar toenemend belang om de moleculaire randvoorwaarden die hun functie te begrijpen. Ten tweede karakterisering van Tau fosforylering is een analytische uitdaging, met 80 mogelijke fosforylatieplaatsen plaatsen langs de sequentie van de langste 441 aminozuur Tau isovorm. Een aantal antilichamen ontwikkeld tegen gefosforyleerde epitopen van tau en worden gebruikt voor detectie van pathologische tau in neuronen of hersenweefsel. Fosforylering evenementen kunnen plaatsvinden op ten minste 20 locaties doelwit van-proline gerichte kinases, de meeste van hen in de buurt binnen de Proline-rijke regio. De kwalitatieve (welke sites?) En kwantitatieve (wat stoichiometrie?) Karakterisering is moeilijk, zelfs door de meest recente MS-technieken 5.

NMR-spectroscopie kan worden gebruikt om ontvouwen eiwitten die sterk dynamische systemen samengesteld uit ensembles conformeren zijn onderzoeken. Hoge-resolutie NMR-spectroscopie was toepased zowel structuur en functie van het tau-eiwit te onderzoeken. Bovendien, de complexiteit van Tau fosforylering profiel geleid tot de ontwikkeling van moleculaire technieken en nieuwe analysemethoden via NMR voor het identificeren van fosforylatieplaatsen 6-8. NMR als een analytische methode het identificeren van tau fosforylatieplaatsen op algemene wijze, visualisatie van de single-site modificaties in één experiment en kwantificering van de mate van Fosfaatopname. Dit punt is van essentieel belang, omdat hoewel fosforylering studies op Tau in overvloed in de literatuur, de meeste van hen zijn uitgevoerd met antilichamen, waardoor een grote mate van onzekerheid over de volledige profiel van fosforylering en daarmee de werkelijke impact van individuele fosforylering gebeurtenissen. Recombinant kinasen waaronder PKA, glycogeen-synthase kinase 3β (GSK3ß), Cycline-afhankelijke kinase 2 / cycline A (CDK2 / CycA), Cycline-afhankelijke kinase 5 (CDK5) / p25 activator eiwitten, extracellulaire signaalgereguleerde kinase 2 (ERK2) en microtubule-affiniteit-regulerende kinase (MARK), waarbij fosforylatie activiteit ten opzichte Tau vertonen, kunnen worden bereid in een actieve vorm. Bovendien worden Tau mutanten die het mogelijk maken de gerichte Tau proteïne isovormen met goed gekarakteriseerde fosforylering patronen die de fosforylering van Tau code ontcijferen. NMR spectroscopie wordt vervolgens gebruikt om enzymatisch gemodificeerde Tau monsters 6 karakteriseren – 8. Hoewel in vitro fosforylering van Tau is moeilijker dan pseudo-fosforylatie zoals door mutatie van geselecteerde Ser / Thr in glutaminezuur (Glu) residuen, deze aanpak heeft zijn voordelen. Inderdaad, noch de structurele gevolgen noch wisselwerkingsparametingen van fosforylatie altijd worden nagebootst door glutaminezuur. Een voorbeeld is de turn motief waargenomen rond 202 fosfoserine (pSer202) / fosfothreonine 205 (pThr205), die niet is weergegeven door Glu mutaties 9.

<p class = "jove_content"> Hier is de bereiding van een isotoop gemerkte Tau voor NMR studies worden eerst beschreven. Tau-eiwit gefosforyleerd door ERK2 wordt gewijzigd op tal van sites beschreven als pathologische plaatsen van fosforylering, en dus een interessant model van gehyperfosforyleerd Tau vertegenwoordigt. Een gedetailleerd protocol van Tau in vitro fosforylering door recombinant ERK2 kinase wordt gepresenteerd. ERK2 wordt geactiveerd door fosforylering door mitogeen geactiveerde proteïne kinase / ERK kinase (MEK) 10-12. Naast de bereiding van gemodificeerde, isotopisch gemerkte Tau-eiwit, is de NMR strategie voor de identificatie van de PTMs beschreven.

Protocol

1. Productie van 15 N, 13 C-Tau (figuur 1) Transformeer pET15b-Tau recombinant T7 expressieplasmide 13,14 in BL21 (DE3) competent Escherichia coli bacteriële cellen 15. Opmerking: het cDNA dat codeert voor de langste (441 aminozuurresiduen) Tau isovorm gekloneerd tussen Ncol en Xhol restrictieplaatsen in het plasmide pET15b. Meng voorzichtig 50 pl competente BL21 (DE3) cellen, vormen 1-5 x 10 7 koloniën per ug …

Representative Results

Figuur 3A toont een grote absorptiepiek bij 280 nm waargenomen tijdens de elutiegradiënt. Deze piek komt overeen met gezuiverd tau-eiwit zoals te zien op de acrylamidegel boven het chromatogram. Figuur 3B toont een goed gescheiden absorptiepiek bij 280 nm en piek geleidbaarheid, zodat ontzouten van het eiwit efficiënt. Figuur 4 toont eiwit gel-shift waargenomen met SDS-PAGE-analyse 16 kenmerkend meerdere proteïne fosforylatie (vergelijk lanen 2 en 3). Figuur 6…

Discussion

We hebben NMR spectroscopie gebruikt om enzymatisch gemodificeerde Tau monsters te karakteriseren. De recombinante expressie en zuivering hier beschreven voor de volledige lengte humaan tau-eiwit kan eveneens worden gebruikt om mutant tau of tau domeinen produceren. Isotopisch verrijkte eiwit is nodig voor NMR-spectroscopie, noodzakelijk recombinante expressie. Identificatie van fosforylatieplaatsen vereist resonantie opdracht en een 15 N, 13 C dubbel gemerkt eiwit. Gezien de kosten van isotopen wo…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer’s disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.

Materials

pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20°C
BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80°C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100X Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4°C
1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20°C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4°C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80°C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer’s disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer’s disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -. X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -. X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochimica. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -. X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -. F., Wieruszeski, J. -. M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer’s disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1’s SH3 domain and Tau’s proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -. G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochimica. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochimica. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Tags

Nuclear Magnetic Resonance SpectroscopyIntrinsically Disordered ProteinsTau ProteinPhosphorylationMolecular RegulationDiseaseProtein InteractionProtein StructureProtein FunctionAPtc VirusTherapyProtein InhibitorsBL21 CellsPlasmid DNALuria Bertani MediumAmpicillinM9 MediumIsotope LabelingRecombinant PlasmidOptical Density
check_url/it/55001?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., Qi, H., Lippens, G., Cantrelle, F., Schneider, R., Hanoulle, X., Smet-Nocca, C., Landrieu, I. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image