JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي لتحديد Phosphorylations متعددة من جوهريا المختلين البروتينات

Published: December 27, 2016
doi:
10.3791/55001
, , , , , , , , , , , ,
1UMR8576, CNRS,Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS,Lille University

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه الرعاية الصحية في القرن الحادي و21 هي أمراض الاعصاب مثل الإصابة بمرض الزهايمر (AD). تاو هو بروتين المرتبط أنيبيب الذي يحفز أنيبيب (MT) تشكيل. وتشارك تاو على قدم المساواة في العديد من الاضطرابات العصبية، يسمى tauopathies، والتي من أشهرها هو م. في هذه الاضطرابات، وجدت تاو المجاميع الذاتي في خيوط حلزونية تقرن (PHFs) وتعديلها على العديد من المخلفات التي تعديلات posttranslational (PTMs) مثل الفسفرة 1. تورط الفسفرة من البروتين تاو في كل تنظيم وظيفة فسيولوجية لاستقرار طن متري، وفقدان المرضية من وظيفة الخلايا العصبية التي تميز م.

وعلاوة على ذلك، بروتين تاو، عند دمجها في PHFs في الخلايا العصبية المريضة، وhyperphosphorylated دائما 2. على عكس تاو الطبيعي أن يحتوي على 2-3 مجموعة الفوسفات، وتاو hyperphosphorylated في PHFs يحتوي على 5-9 الفوسفاطالمجموعات الإلكترونية 3. Hyperphosphorylation من تاو يتوافق على حد سواء لزيادة العناصر المتفاعلة في بعض المواقع والفسفرة من المواقع الإضافية التي تسمى مواقع المرضية من الفسفرة. ومع ذلك، يوجد تداخل بين الميلادي وأنماط البالغين الطبيعية من الفسفرة، على الرغم من الاختلافات الكمية في مستوى 4. كيف محددة الأحداث الفسفرة وظيفة النفوذ واختلال وظيفي تاو لا تزال مجهولة إلى حد كبير. ونحن نهدف إلى فك تنظيم تاو كتبها PTMs على المستوى الجزيئي.

لتعميق فهم الجوانب الجزيئية تاو، لدينا لمعالجة التحديات التقنية. أولا، تاو هو بروتين المختلين جوهريا (IDP) عندما معزولة في الحل. هذه البروتينات تفتقر محددة جيدا هيكل ثلاثي الأبعاد في ظل الظروف الفسيولوجية وتتطلب معينة الطرق الفيزيائية الحيوية لدراسة وظيفة (ق) والخصائص الهيكلية. تاو هو نموذج لفئة متزايدة من النازحين، وكثيرا ما وجدت المرتبطةالأمراض مثل الأمراض العصبية، وبالتالي زيادة الفائدة على فهم المعلمات الجزيئية الكامنة وراء وظائفهم. ثانيا، توصيف تاو الفسفرة هو التحدي التحليلي، مع 80 موقعا الفسفرة المحتملة على طول سلسلة من أطول 441 الأحماض الأمينية تاو الإسوي. وقد تم تطوير عدد من الأجسام المضادة ضد الحواتم فسفرته من تاو وتستخدم للكشف عن تاو المرضية في الخلايا العصبية أو أنسجة المخ. يمكن أن الأحداث الفسفرة يومي لا يقل عن 20 المواقع المستهدفة من قبل تحركات الموجه البرولين، معظمهم على مقربة داخل المنطقة البرولين الغنية. النوعي (المواقع التي؟) وتوصيف كمي (ما رياضيات الكيمياء؟) صعبة حتى من قبل تقنيات MS أحدث 5.

مطيافية الرنين النووي المغناطيسي يمكن استخدامها لتحقيق البروتينات المختلين التي هي غاية الأنظمة الديناميكية تتألف من مجموعات من المتشاكلات. كان عالية الدقة الرنين المغناطيسي الطيفي تطبيق صحيفةإد للتحقيق في كل من هيكل ووظيفة البروتين تاو. وبالإضافة إلى ذلك، أدى إلى تعقيد الملف الشخصي الفسفرة تاو لتطوير الأدوات الجزيئية وطرق تحليلية جديدة باستخدام الرنين المغناطيسي لتحديد المواقع الفسفرة 6-8. الرنين المغناطيسي النووي باعتباره المنهج التحليلي تسمح لتحديد المواقع الفسفرة تاو بطريقة العالمية، والتصور من جميع التعديلات في موقع واحد في تجربة واحدة، وتقدير مدى التأسيس الفوسفات. هذه نقطة أساسية منذ الرغم من أن الدراسات الفسفرة على تاو وتكثر في الأدب، ومعظمهم تم تنفيذها مع الأجسام المضادة، وترك درجة كبيرة من عدم اليقين بشأن الوضع الكامل من الفسفرة وبالتالي التأثير الحقيقي للأحداث الفسفرة الفردية. تحركات المؤتلف بما في ذلك PKA، الجليكوجين-سينسيز كيناز 3β (Gsk3β)، السيكلين التي تعتمد كيناز 2 / السيكلين ألف (CDK2 / CycA)، كيناز السيكلين التي تعتمد 5 (CDK5) / P25 عمل البروتين ivator، تنظم خارج الخلية إشارة كيناز 2 (ERK2) وأنيبيب-التنظيم تقارب كيناز (MARK)، والتي تظهر نشاط الفسفرة نحو تاو، يمكن أن تكون مستعدة في شكل نشط. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام المسوخ تاو التي تسمح لتوليد الأشكال الإسوية بروتين تاو محددة مع أنماط الفسفرة جيدا اتسم فك شفرة الفسفرة تاو. ثم يتم استخدام الرنين المغناطيسي الطيفي لتحديد خصائص العينات تاو تعديل إنزيمي 6-8. على الرغم من أن في المختبر الفسفرة تاو هو أكثر صعوبة من شبه الفسفرة مثل قبل الطفرة المحدد سر / منتدى المجالس الرومانسية إلى حمض الجلوتاميك (غلو) المخلفات، وهذا النهج مزاياه. في الواقع، لا المعلمات تأثير ولا التفاعل الهيكلية للالفسفرة يمكن دائما تحاكي بواسطة الأحماض الجلوتاميك. ومن الأمثلة على ذلك عزر بدوره لاحظ حول phosphoserine 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205)، والتي لا تتكرر مع الطفرات غلو 9.

<p class = "jove_content"> هنا، وسيتم وصف إعداد تاو المسمى isotopically للتحقيقات الرنين المغناطيسي النووي أولا. يتم تعديل بروتين تاو فسفرته بواسطة ERK2 على مواقع عديدة وصفها بأنها مواقع المرضية من الفسفرة، وبالتالي يمثل نموذجا للاهتمام من تاو hyperphosphorylated. ويرد بروتوكول مفصلة من تاو في الفسفرة المختبر بواسطة كيناز ERK2 المؤتلف. يتم تنشيط ERK2 من الفسفرة من قبل mitogen تنشيط بروتين كيناز / إرك كيناز (مجاهدي خلق) 10-12. بالإضافة إلى إعداد تعديل، بروتين تاو المسمى isotopically، يوصف استراتيجية NMR تستخدم لتحديد PTMs.

Protocol

1. إنتاج 15 N، 13 C-تاو (الشكل 1) تحويل pET15b-تاو T7 المؤتلف التعبير البلازميد 13،14 في BL21 (DE3) المختصة كولاي الخلايا البكتيرية 15. ملاحظة: الترميز [كدنا لأطول (441 بقايا الأحماض الأمينية) تاو الإسوي ه?…

Representative Results

ويبين الشكل 3A ذروة امتصاص الرئيسية في 280 نانومتر لوحظت خلال التدرج شطف. هذه الذروة يتوافق مع بروتين تاو تنقيته كما هو ظاهر على هلام الأكريلاميد فوق اللوني. ويبين الشكل 3B ذروة امتصاص فصل جيدا في 280 نانومتر، وذروة الموصلية، وضمان أن إزالة الأملاح من البروتين فعال…

Discussion

وقد استخدمنا مطيافية الرنين النووي المغناطيسي لتحديد خصائص العينات تاو تعديل إنزيمي. يمكن كذلك التعبير المؤتلف وتنقية وصفها هنا للحصول على كامل طول البروتين تاو البشري أن تستخدم لإنتاج متحولة تاو تاو أو المجالات. نظائريا هناك حاجة إلى البروتين المخصب لمطيافية الرن…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer’s disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.

Materials

pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20°C
BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80°C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100X Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4°C
1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20°C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4°C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80°C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer’s disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer’s disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -. X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -. X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochimica. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -. X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -. F., Wieruszeski, J. -. M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer’s disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1’s SH3 domain and Tau’s proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -. G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochimica. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochimica. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Tags

Nuclear Magnetic Resonance SpectroscopyIntrinsically Disordered ProteinsTau ProteinPhosphorylationMolecular RegulationDiseaseProtein InteractionProtein StructureProtein FunctionAPtc VirusTherapyProtein InhibitorsBL21 CellsPlasmid DNALuria Bertani MediumAmpicillinM9 MediumIsotope LabelingRecombinant PlasmidOptical Density
check_url/it/55001?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., Qi, H., Lippens, G., Cantrelle, F., Schneider, R., Hanoulle, X., Smet-Nocca, C., Landrieu, I. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image