आंतरिक रूप से बेक़ायदा प्रोटीन के एकाधिक Phosphorylations की पहचान के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी
Summary
We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.
Abstract
Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.
Introduction
21 वीं सदी में स्वास्थ्य सेवा की मुख्य चुनौतियों में से एक ऐसे अल्जाइमर रोग (ई) के रूप में neurodegenerative रोगों कर रहे हैं। ताउ एक microtubule जुड़े प्रोटीन है कि उत्तेजित microtubule (एमटी) गठन है। ताऊ समान रूप से, कई neurodegenerative विकारों में शामिल है तथाकथित tauopathies, जिनमें से सबसे अच्छा ज्ञात विज्ञापन है। इन विकारों में, बनती पेचदार तंतु (PHFs) में ताऊ आत्म-समुच्चय और पाया जाता है जैसे कि फोस्फोराइलेशन 1 के रूप में posttranslational संशोधनों (PTMs) द्वारा कई अवशेषों पर संशोधित। ताउ प्रोटीन की Phosphorylation मीट्रिक टन स्थिरीकरण और उस विज्ञापन न्यूरॉन्स की विशेषता समारोह के रोग नुकसान की अपनी शारीरिक समारोह के दोनों नियमन में फंसा है।
इसके अलावा, ताउ प्रोटीन, जब रोगग्रस्त न्यूरॉन्स में PHFs में एकीकृत, सदा ही 2 hyperphosphorylated है। सामान्य ताउ कि 2-3 फॉस्फेट समूहों में शामिल है के विपरीत, PHFs में hyperphosphorylated ताउ शामिल करने के लिए 5 9 phosphatई समूहों 3। ताऊ की Hyperphosphorylation दोनों कुछ स्थलों पर और अतिरिक्त साइटों है कि फोस्फोराइलेशन के रोग साइटों कहा जाता है के फोस्फोराइलेशन को stoichiometry की वृद्धि से मेल खाती है। हालांकि, ओवरलैप स्तर 4 में मात्रात्मक मतभेदों के बावजूद, विज्ञापन और फोस्फोराइलेशन के सामान्य वयस्क पैटर्न के बीच मौजूद है। कैसे विशिष्ट फोस्फोराइलेशन घटनाओं को प्रभावित समारोह और ताऊ की शिथिलता काफी हद तक अनजान बनी हुई है। हम आणविक स्तर पर PTMs द्वारा ताउ विनियमन समझने के लिए लक्ष्य।
ताऊ की आणविक पहलुओं की समझ को गहरा करने के लिए, हम तकनीकी चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। सबसे पहले, ताऊ एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन (आईडीपी) जब समाधान में अलग है। इस तरह के प्रोटीन शारीरिक शर्तों के तहत अच्छी तरह से परिभाषित तीन आयामी संरचना की कमी है और उनके कार्य (एस) और संरचनात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से biophysical तरीकों की आवश्यकता है। ताऊ विस्थापितों की बढ़ती वर्ग के लिए एक प्रतिमान है, अक्सर के साथ जुड़े पायाऐसे neurodegenerative रोगों के रूप में विकृतियों, इसलिए ब्याज बढ़ रही है उनके कार्यों अंतर्निहित आणविक मानकों को समझने के लिए। दूसरे, ताऊ फोस्फोराइलेशन के लक्षण वर्णन के सबसे लंबे समय तक 441 अमीनो एसिड ताउ isoform के अनुक्रम के साथ 80 संभावित फोस्फोराइलेशन साइटों के साथ, एक विश्लेषणात्मक चुनौती है। एंटीबॉडी के एक नंबर ताउ के फॉस्फोरिलेटेड epitopes के खिलाफ विकसित किया गया है और न्यूरॉन्स या मस्तिष्क के ऊतकों में रोग ताऊ का पता लगाने के लिए किया जाता है। Phosphorylation घटनाओं प्रोलाइन समृद्ध क्षेत्र के भीतर करीब निकटता में उनमें से ज्यादातर कम से कम 20 साइटों प्रोलाइन निर्देशित kinases द्वारा लक्षित पर जगह ले सकते हैं। गुणात्मक (जो साइटों?) और मात्रात्मक (क्या stoichiometry?) लक्षण वर्णन भी सबसे हाल ही में एमएस तकनीक 5 से मुश्किल है।
एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी अव्यवस्थित प्रोटीन है कि अत्यधिक गतिशील conformers की टुकड़ियों की व्यवस्था कर रहे हैं गठित जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उच्च संकल्प एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी appli थाएड दोनों संरचना और ताउ प्रोटीन के समारोह में जांच करने के लिए। 8 – इसके अलावा, ताऊ के फोस्फोराइलेशन प्रोफ़ाइल की जटिलता आणविक उपकरण और नई विश्लेषणात्मक तरीकों फोस्फोराइलेशन साइटों 6 की पहचान के लिए एनएमआर का उपयोग कर के विकास के लिए नेतृत्व किया। एक विश्लेषणात्मक पद्धति के रूप में एनएमआर एक वैश्विक ढंग से ताउ फोस्फोराइलेशन साइटों की पहचान, एक ही प्रयोग में सभी एकल साइट संशोधनों के दृश्य, और फॉस्फेट समावेश की हद तक की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। इस बिंदु के बाद से आवश्यक हालांकि ताउ पर फोस्फोराइलेशन पढ़ाई के साहित्य में जाना लाजिमी है, उनमें से ज्यादातर एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया गया है, एक बड़े फोस्फोराइलेशन का पूरा प्रोफ़ाइल से अधिक व्यक्ति फोस्फोराइलेशन घटनाओं का असली प्रभाव अनिश्चितता की डिग्री है और इस प्रकार जा रही है। PKA, ग्लाइकोजन-synthase काइनेज 3β (Gsk3β), Cyclin निर्भर काइनेज 2 / cyclin एक (CDK2 / CycA), Cyclin निर्भर काइनेज 5 (CDK5) / P25 अधिनियम सहित संयोजक kinasesivator प्रोटीन, बाह्य संकेत विनियमित काइनेज 2 (ERK2) और microtubule आत्मीयता विनियमन काइनेज (मार्क), जो ताऊ की ओर फोस्फोराइलेशन गतिविधि दिखाने के लिए, एक सक्रिय रूप में तैयार किया जा सकता है। इसके अलावा, ताऊ म्यूटेंट कि अच्छी तरह से विशेषता फोस्फोराइलेशन पैटर्न के साथ विशिष्ट ताउ प्रोटीन isoforms पैदा करने के लिए अनुमति देने के ताऊ के फोस्फोराइलेशन कोड समझने के लिए उपयोग किया जाता है। 8 – एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी तो enzymatically संशोधित ताउ नमूने 6 को चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि ताऊ की इन विट्रो phosphorylation ऐसे glutamic एसिड (ग्लू) अवशेषों में चयनित सर्विसेज / Thr के उत्परिवर्तन के रूप में छद्म फोस्फोराइलेशन से ज्यादा चुनौतीपूर्ण है, इस दृष्टिकोण अपने गुण है। दरअसल, फोस्फोराइलेशन से न तो संरचनात्मक प्रभाव है और न ही बातचीत के मानकों को हमेशा glutamic एसिड से मजाक उड़ाया जा सकता है। एक उदाहरण मोड़ के आसपास phosphoserine 202 (pSer202) मनाया मूल भाव / phosphothreonine 205 (pThr205), जो ग्लू म्यूटेशन 9 के साथ reproduced नहीं है।
<p claएस एस = "jove_content"> यहाँ, एनएमआर जांच के लिए isotopically लेबल ताऊ की तैयारी पहले वर्णित किया जाएगा। ताउ प्रोटीन ERK2 द्वारा phosphorylated फोस्फोराइलेशन के रोग साइटों के रूप में वर्णित कई साइटों पर संशोधित किया गया है, और इस तरह hyperphosphorylated ताऊ का एक दिलचस्प मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। पुनः संयोजक ERK2 काइनेज द्वारा इन विट्रो phosphorylation में ताऊ की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। 12 – ERK2 माइटोजन सक्रिय प्रोटीन काइनेज / ERK काइनेज (खल्क) 10 से फोस्फोराइलेशन से सक्रिय है। संशोधित, isotopically लेबल ताउ प्रोटीन की तैयारी के अलावा, PTMs की पहचान के लिए इस्तेमाल किया एनएमआर रणनीति में वर्णित है।Protocol
Representative Results
Discussion
हम एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया है enzymatically संशोधित ताउ नमूनों को चिह्नित करने के लिए। पुनः संयोजक अभिव्यक्ति और यहाँ पूर्ण लंबाई मानव ताउ प्रोटीन के लिए वर्णित शुद्धि इसी तरह उत्परिवर्ती ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer’s disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.
Materials
| pET15B recombinant T7 expression plasmid | Novagen | 69257 | Keep at -20°C |
| BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria | New England Biolabs | C2527I | Keep at -80°C |
| Autoclaved LB Broth, Lennox | DIFCO | 240210 | Bacterial Growth Medium |
| MEM vitamin complements 100X | Sigma | 58970C | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15N, 13C-ISOGRO complete medium powder | Sigma | 608297 | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15NH4Cl | Sigma | 299251 | Isotope |
| 13C6-Glucose | Sigma | 389374 | Isotope |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 5056489001 | Keep at 4°C |
| 1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C | |||
| DNaseI | EUROMEDEX | 1307 | Keep at -20°C |
| Homogenizer (EmulsiFlex-C3) | AVESTIN | Lysis is realized at 4°C | |
| Pierce™ Unstained Protein MW Marker | Pierce | 266109 | |
| Active human MEK1 kinase, GST Tagged | Sigma | M8822 | Keep at -80°C |
| AKTÄ Pure chromatography system | GE Healthcare | FPLC | |
| HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column) | GE Healthcare | 17-5156-01 | Cation exchange chromatography columns |
| HiPrep 26/10 Desalting | GE Healthcare | 17-5087-01 | Protein Desalting column |
| PD MidiTrap G-25 | GE Healthcare | 28-9180-08 | Protein Desalting column |
| Tris D11, 97% D | Cortecnet | CD4035P5 | Deuterated NMR buffer |
| 5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe) | Euriso-top | BMS-005B | NMR Shigemi Tubes |
| eVol kit-electronic syringe starter kit | Cortecnet | 2910000 | Pipetting |
| Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| TopSpin 3.1 | Bruker | Acquisition and Processing software for NMR experiments | |
| Sparky 3.114 | UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) | NMR data Analysis software |
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