Nuclear Magnetic Resonance spektroskopi for identifisering av flere Phosphorylations med egen Uordnede Proteiner

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

En av de viktigste utfordringene i helsevesenet i det ^21. århundre er nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom (AD). Tau er en microtubule assosiert protein som stimulerer microtubule (MT) formasjon. Tau er like involvert i flere nevrodegenerative lidelser, såkalte tauopatier, hvorav den mest kjente er AD. I disse lidelsene, er Tau selv aggregater i sammenkoblede spiraltråder (PHFs) og funnet endret mange rester av posttranslational modifikasjoner (PTMs) som fosforylering ^en. Fosforylering av tau-protein er implisert i reguleringen av både dets fysiologiske funksjon av MT stabilisering og patologisk tap av funksjon som karakteriserer AD nerveceller.

Videre Tau protein, når de er integrert i PHFs i syke nevroner, er alltid hyperfosforylert ^to. I motsetning til vanlige Tau som inneholder 2-3 fosfatgrupper, den hyperfosforylisert Tau i PHFs inneholder 5-9 phosphate gruppe ^3. Hyperfosforylering av Tau tilsvarer både en økning på støkiometri på noen områder og til fosforylering av flere nettsteder som er kalt patologiske områder av fosforylering. Imidlertid eksisterer overlapping mellom AD og normale voksne mønstre av fosforylering, til tross for kvantitative forskjeller i nivå ^4. Hvordan spesifikk fosforylering hendelser innflytelse funksjon og dysfunksjon av Tau fortsatt i stor grad ukjent. Vi tar sikte på å dechiffrere Tau regulering av PTMs på molekylært nivå.

For å utdype forståelsen av de molekylære aspekter av Tau, må vi løse tekniske utfordringer. For det første er Tau en egen uordnede protein (IDP) når isolert i løsningen. Slike proteiner mangler veldefinert tredimensjonal struktur under fysiologiske betingelser, og krever spesielle biofysiske metoder for å studere deres funksjon (er) og strukturelle egenskaper. Tau er et paradigme for den voksende klassen av internt fordrevne, ofte funnet i forbindelse medpatologi som nevrodegenerative sykdommer, dermed øker interessen for å forstå de molekylære parametre bak sine funksjoner. For det andre, er karakteriseringen av Tau fosforylering en analytisk utfordring med 80 potensielle fosforyleringsseter langs sekvensen av den lengste 441 aminosyre-Tau isoform. En rekke antistoffer har blitt utviklet mot fosforylerte epitoper av Tau og anvendes for påvisning av patologiske Tau i neuronene eller hjernevev. Fosforylering hendelser kan finne sted på i det minste 20 områder målrettet av prolin-dirigert kinaser, de fleste av dem i umiddelbar nærhet innenfor prolin-rik region. Den kvalitative (hvilke områder?) Og kvantitativ (hva støkiometri?) Karakterisering er vanskelig selv etter de siste MS teknikker ^5.

NMR-spektroskopi kan anvendes for å undersøke uordnede proteiner som er sterkt dynamiske systemer som utgjøres av ensembler av konformerer. Høy oppløsning NMR-spektroskopi var apparaed å undersøke både struktur og funksjon av Tau protein. I tillegg kompleksiteten av Tau fosforylering profil førte til utviklingen av molekylære verktøy og nye analysemetoder ved hjelp av NMR for identifisering av fosforyleringsseter ^{6 – 8.} NMR som en analytisk metode gjør det mulig for identifisering av Tau fosforyleringsseter i et globalt måte, visualisering av alle enkeltsted endringer i et enkelt eksperiment, og kvantifisering av graden av fosfat inkorporering. Dette punktet er viktig siden selv om fosforylering studier på Tau florerer i litteraturen, de fleste av dem har blitt utført med antistoffer, og etterlater en stor grad av usikkerhet over hele profilen til fosforylering og dermed den sanne betydningen av individuelle fosforylering hendelser. Rekombinante kinaser inkludert PKA, glykogen-syntase-kinase 3β (GSK3P), syklin-avhengig kinase 2 / cyklin A (CDK2 / CycA), syklin-avhengig kinase 5 (cdk5) / p25 activator protein, ekstracellulære signalregulert kinase 2 (ERK2) og microtubule-affinitet regulerende kinase (MARK), som viser fosforyleringsaktivitet mot Tau, kan tilberedes på en aktiv form. I tillegg er Tau mutanter som gjør det mulig for generering av spesifikke tau-protein isoformene med godt karakterisert fosforylering mønstre anvendes for å dechiffrere koden fosforylering av Tau. NMR-spektroskopi blir så brukt for å karakterisere enzymatisk modifiserte Tau prøvene ^{6 – 8.} Selv om in vitro-fosforylering av Tau er mer utfordrende enn pseudo-fosforylering slik som ved mutasjon av den valgte Ser / Thr inn i glutaminsyre (Glu) rester Denne tilnærming har sine fordeler. Faktisk kan verken strukturelle støt eller interaksjons parametere av fosforylering alltid bli etterlignet av glutaminsyre. Et eksempel er turn motiv observert rundt fosfoserin- 202 (pSer202) / fosfotreoninmimetikumet 205 (pThr205), som ikke er gjengitt med Glu mutasjoner ^9.

<p class = "jove_content"> Her, utarbeidelse av isotopisk merket Tau for NMR undersøkelser vil bli beskrevet først. Tau protein fosforylert av ERK2 er endret på en rekke områder som er beskrevet som patologiske områder av fosforylering, og dermed representerer en interessant modell av hyperfosforylisert Tau. En detaljert protokoll for Tau in vitro-fosforylering ved hjelp av rekombinant ERK2 kinase er presentert. ERK2 er aktivert ved fosforylering av mitogen aktivert proteinkinase / ERK-kinase (MEK) ^{10 – 12.} I tillegg til fremstilling av modifiserte, isotopisk-merkede Tau-protein, er NMR-strategi som brukes for å identifisere den PTMs rives.

Protocol

1. Fremstilling av N 15, 13 C-Tau (figur 1) Transform pET15b-Tau rekombinant T7 ekspresjonsplasmidet 13,14 i BL21 (DE3) kompetent Escherichia coli bakterieceller 15. MERK: cDNA som koder for den lengste (441 aminosyreresidier) Tau isoform er klonet mellom Ncol og Xhol restriksjonssetene i pET15b plasmid. Bland forsiktig 50 pl av kompetente BL21 (DE3) celler, som danner 1-5 x 10 7 kolonier pr ug av plasmid-DNA, me…

Representative Results

Figur 3A viser en større absorpsjonstopp ved 280 nm observert i løpet av elueringsgradient. Denne toppen tilsvarer rensede Tau-protein som sett på akrylamidgel ovenfor kromatogrammet. Figur 3B viser en godt adskilt absorpsjonstopp ved 280 nm og toppen av ledeevne, slik at avsalting av proteinet er effektiv. Figur 4 viser protein-gel-skift observert ved hjelp av SDS-PAGE-analyse 16 karakteristisk for multiple protein fosforylering (sammenlign spor 2 og 3). Figur 6</stro…

Discussion

Vi har brukt NMR-spektroskopi for å karakterisere enzymatisk modifiserte Tau prøver. Den rekombinante ekspresjon og rensing som er beskrevet her for full-lengde humant Tau-protein kan på lignende måte bli brukt til å fremstille mutant Tau eller Tau-domener. Isotopisk anrikede protein som er nødvendig for NMR-spektroskopi, hvilket nødvendig rekombinant ekspresjon. Identifisering av fosforyleringsseter krever resonans oppdrag og en ¹⁵ N, ¹³ C dobbelt merket protein. Gitt kostnad av isotoper, e…

Materials

pET15B recombinant T7 expression plasmid	Novagen	69257	Keep at -20°C
BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria	New England Biolabs	C2527I	Keep at -80°C
Autoclaved LB Broth, Lennox	DIFCO	240210	Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100X	Sigma	58970C	Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder	Sigma	608297	Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl	Sigma	299251	Isotope
13C6-Glucose	Sigma	389374	Isotope
Protease inhibitor tablets	Roche	5056489001	Keep at 4°C
			1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	Keep at -20°C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3)	AVESTIN		Lysis is realized at 4°C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker	Pierce	266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged	Sigma	M8822	Keep at -80°C
AKTÄ Pure chromatography system	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column)	GE Healthcare	17-5156-01	Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting	GE Healthcare	17-5087-01	Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	Protein Desalting column
Tris D11, 97% D	Cortecnet	CD4035P5	Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe)	Euriso-top	BMS-005B	NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit	Cortecnet	2910000	Pipetting
Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1	Bruker		Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114	UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)		NMR data Analysis software