Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas
Summary
We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.
Abstract
Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.
Introduction
Um dos principais desafios da saúde no século 21 são as doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA). Tau é uma proteína associada a microtúbulos que estimula a formação de microtúbulos (MT). Tau está igualmente envolvido em várias doenças neurodegenerativas, os chamados tauopatias, dos quais o mais conhecido é AD. Nestes distúrbios, Tau auto-agregados em filamentos helicoidais emparelhados (PHFs) e é encontrado modificado em muitos resíduos por modificações pós-translacionais (PTMS), tais como fosforilação 1. A fosforilação da proteína tau está implicado tanto na regulação da sua função fisiológica de estabilização de MT e da perda da função patológica que caracteriza neurónios AD.
Além disso, a proteína Tau, quando integrado no PHF em neurónios doentes, é invariavelmente hiperfosforilada 2. Ao contrário Tau normal que contém 2-3 grupos fosfato, o Tau hiperfosforilada em PHF contém 5-9 phosphate os grupos 3. Hiperfosforilação de Tau corresponde tanto a um aumento da estequiometria em alguns locais e a fosforilação de sítios adicionais que são chamados locais de fosforilação patológicas. No entanto, existe sobreposição entre AD e padrões adultos normais de fosforilação, apesar das diferenças quantitativas no nível 4. Como eventos de fosforilação função de influência e disfunção de Tau específica permanece em grande parte desconhecido. Nosso objetivo é decifrar regulação Tau por PTMs no nível molecular.
Para aprofundar a compreensão dos aspectos moleculares de Tau, temos de enfrentar os desafios técnicos. Em primeiro lugar, uma proteína tau é intrinsecamente desordenados (PDI), quando isolados em solução. Estas proteínas não têm estrutura tridimensional bem definida em condições fisiológicas e requerem determinados métodos biofísicos para estudar a sua função (s) e as propriedades estruturais. Tau é um paradigma para a crescente classe dos deslocados internos, muitas vezes encontrados associadospatologias como doenças neurodegenerativas, aumentando assim o interesse para compreender os parâmetros moleculares subjacentes suas funções. Em segundo lugar, a caracterização de Tau fosforilação é um desafio analítico, com 80 potenciais locais de fosforilação ao longo da sequência da tau isoforma mais longa 441 amino-ácido. Um certo número de anticorpos têm sido desenvolvidos contra epítopos de tau fosforilados e são utilizados para a detecção de tau patológica em neurónios ou tecido cerebral. eventos de fosforilação pode ter lugar em, pelo menos 20 locais visados pelas cinases dirigidas-prolina, a maioria deles em estreita proximidade no interior da região rica em prolina. O qualitativa (que sites?) E caracterização quantitativa (o que estequiometria?) É difícil, mesmo pelas mais recentes técnicas de MS 5.
espectroscopia de RMN pode ser utilizada para investigar as proteínas desordenados que são altamente dinâmicos sistemas constituídos por conjuntos de confórmeros. espectroscopia de RMN de alta resolução foi apliEd para investigar a estrutura e função da proteína tau. Além disso, a complexidade do perfil a fosforilação da tau, levou ao desenvolvimento de ferramentas moleculares e novos métodos de análise utilizando RMN para a identificação de sítios de fosforilação 6 – 8. RMN como um método analítico permite a identificação de locais de fosforilação da tau de um modo global, a visualização de todas as modificações de sítio único numa única experiência, e a quantificação da extensão da incorporação de fosfato. Este ponto é essencial, pois embora os estudos de fosforilação sobre Tau abundam na literatura, a maioria deles têm sido realizados com anticorpos, deixando um grande grau de incerteza sobre o perfil completo de fosforilação e, assim, o verdadeiro impacto de eventos de fosforilação individuais. cinases recombinantes incluindo PKA, 3β glicogênio sintase-quinase (Gsk3β), ciclina dependente de quinase 2 / ciclina A (CDK2 / CycA), quinase ciclina-dependentes 5 (CDK5) / p25 actproteína ivator,-extracelular sinal-quinase regulada 2 (ERK2) e microtúbulos-quinase regula-afinidade (MARK), que apresentam uma actividade no sentido de fosforilação da tau, pode ser preparada numa forma activa. Além disso, os mutantes Tau que permitem a geração de isoformas da proteína tau específicas com padrões de fosforilação bem caracterizados são usadas para decifrar o código de fosforilação de tau. Espectroscopia de RMN é então usado para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados 6 – 8. Embora a fosforilação in vitro de tau é mais difícil do que o pseudo-fosforilação tal como por mutação da seleccionados Ser / Thr em resíduos de ácido glutâmico (Glu), esta abordagem tem as suas vantagens. De facto, nem os parâmetros de impacto nem interacção estruturais de fosforilação pode sempre ser mimetizado por ácidos glutâmicos. Um exemplo é o motivo por sua vez observada em torno fosfoserina 202 (pSer202) / fosfotreonina 205 (pThr205), que não é reproduzida com Glu mutações 9.
<p class = "jove_content"> Aqui, a preparação de Tau marcado isotopicamente para investigações de RMN serão descritos em primeiro lugar. proteína tau fosforilada por ERK2 é modificado em vários sites descritos como locais patológicos de fosforilação, e, portanto, representa um interessante modelo de Tau hiperfosforilada. Um protocolo detalhado de Tau na fosforilação in vitro pela quinase ERK-2 recombinante é apresentada. ERK2 é activada por fosforilação de proteína quinase activada mitogénio / ERK-cinase (MEK) 10-12. Além disso para a preparação de proteína Tau modificado, marcado isotopicamente, a estratégia de RMN utilizado para a identificação do PTMs é descrito.Protocol
Representative Results
Discussion
Temos usado espectroscopia de RMN para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados. A expressão recombinante e purificação descritos aqui para a proteína tau humana de comprimento completo podem ser igualmente utilizados para produzir domínios tau ou mutantes Tau. Isotopicamente enriquecido proteína é necessária para a espectroscopia de RMN, necessitando de expressão recombinante. Identificação dos locais de fosforilação exige atribuição de ressonância e uma proteína duplamente marcada de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer’s disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.
Materials
| pET15B recombinant T7 expression plasmid | Novagen | 69257 | Keep at -20°C |
| BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria | New England Biolabs | C2527I | Keep at -80°C |
| Autoclaved LB Broth, Lennox | DIFCO | 240210 | Bacterial Growth Medium |
| MEM vitamin complements 100X | Sigma | 58970C | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15N, 13C-ISOGRO complete medium powder | Sigma | 608297 | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15NH4Cl | Sigma | 299251 | Isotope |
| 13C6-Glucose | Sigma | 389374 | Isotope |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 5056489001 | Keep at 4°C |
| 1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C | |||
| DNaseI | EUROMEDEX | 1307 | Keep at -20°C |
| Homogenizer (EmulsiFlex-C3) | AVESTIN | Lysis is realized at 4°C | |
| Pierce™ Unstained Protein MW Marker | Pierce | 266109 | |
| Active human MEK1 kinase, GST Tagged | Sigma | M8822 | Keep at -80°C |
| AKTÄ Pure chromatography system | GE Healthcare | FPLC | |
| HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column) | GE Healthcare | 17-5156-01 | Cation exchange chromatography columns |
| HiPrep 26/10 Desalting | GE Healthcare | 17-5087-01 | Protein Desalting column |
| PD MidiTrap G-25 | GE Healthcare | 28-9180-08 | Protein Desalting column |
| Tris D11, 97% D | Cortecnet | CD4035P5 | Deuterated NMR buffer |
| 5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe) | Euriso-top | BMS-005B | NMR Shigemi Tubes |
| eVol kit-electronic syringe starter kit | Cortecnet | 2910000 | Pipetting |
| Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| TopSpin 3.1 | Bruker | Acquisition and Processing software for NMR experiments | |
| Sparky 3.114 | UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) | NMR data Analysis software |
Riferimenti
- Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
- Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer’s disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
- Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
- Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer’s disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
- Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
- Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
- Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
- Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
- Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
- Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
- Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
- Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
- Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
- Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
- Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
- Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
- Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
- Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
- Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
- Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
- Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
- Theillet, F. -. X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Qi, H., Cantrelle, F. -. X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochimica. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
- Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
- Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -. X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
- Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Bodart, J. -. F., Wieruszeski, J. -. M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
- Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
- Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer’s disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
- Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
- Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
- Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
- Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1’s SH3 domain and Tau’s proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
- Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
- Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
- Milroy, L. -. G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
- Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochimica. 43 (7), 2032-2040 (2004).
- Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
- Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
- Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
- Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
- Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochimica. 53 (18), 3020-3032 (2014).
