Introduction
La principale causa di mortalità per cancro al seno è attraverso le metastasi 1, 2. Taxani, come docetaxel e paclitaxel, sono attualmente utilizzati come prima linea di regimi nel trattamento del carcinoma mammario metastatico 2, 3, 4, 5, 6. Fanno parte di un gruppo di agenti microtubuli-targeting (MTA) che interrompono la dinamica dei microtubuli. Tuttavia, una delle più grandi sfide di utilizzare taxani nella terapia curativa è lo sviluppo della resistenza taxani nelle cellule tumorali, che porta alla malattia recidiva 7. La resistenza ai farmaci rappresenta oltre il 90% di tutti i decessi tra i pazienti con carcinoma mammario metastatico 7.
I microtubuli sono formati dalla polimerizzazione di eterodimeri alfa- e beta-tubulinaclass = "xref"> 8, 9. La regolazione precisa della dinamica dei microtubuli è importante per molte funzioni cellulari, tra cui la polarizzazione delle cellule, progressione del ciclo cellulare, trasporto intracellulare, e segnalazione cellulare. Disregolazione dei microtubuli e le loro dinamiche interromperà la funzione delle cellule e causare la morte delle cellule 10, 11. A seconda di come essi causano questa disregolazione, farmaci MTA possono essere classificati come agenti dei microtubuli di stabilizzazione (ad esempio, taxani) o agenti microtubuli destabalizing (cioè, alcaloidi della vinca o colchicina loco agenti leganti) 20. Nonostante i loro effetti opposti sulla massa microtubuli, ad una dose sufficiente, entrambe le classi possono uccidere le cellule tumorali attraverso i loro effetti sulla dinamica dei microtubuli 21.
Taxani funzionano principalmente dalla stabilizzazione del microtubulo del mandrino 12, che porta adisallineamento cromosomica. La successiva attivazione perpetua del punto di controllo di assemblaggio del mandrino (SAC) arresta la cella in mitosi. Mitotico arresto prolungato provoca quindi l'apoptosi 13, 14. Taxano interagisce con microtubuli attraverso il sito di legame taxano on β-tubulina 8, 15, che è presente solo in tubulina assemblato 16.
Meccanismi multipli per resistenza taxani sono stati proposti 9, 17. Questi meccanismi comprendono sia la resistenza ai farmaci in generale a causa della sovraespressione di proteine droga efflusso e specifici taxano resistenza 5, 9, 18, 19. Ad esempio, le cellule tumorali taxani resistenti potrebbero aver alterato espressione e la funzione di alcuni β-tubulin isotipi 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Utilizzando un metodo in vivo per misurare microtubuli instabilità dinamica, dimostriamo che, rispetto ai non-resistenti, parentali cellule MCF-7 CC 17, la dinamica dei microtubuli di cellule MCF-7 TXT docetaxel-resistenti sono insensibili al trattamento con docetaxel.
Per capire meglio la funzione di MTA e l'esatto meccanismo di taxano-resistenza in cellule cancerose, è essenziale misurare dinamica dei microtubuli. Qui riportiamo un metodo in vivo di farlo. Utilizzando immagini dal vivo, in combinazione con l'espressione di tubulina GFP-tagged nelle cellule, siamo in grado di misurare la dinamica dei microtubuli di MCF-7 TXT e le cellule CC MCF-7 con e wisarie, senza trattamento con docetaxel. I risultati possono aiutarci a progettare farmaci più efficaci che possono superare la resistenza taxano.
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Protocol
1. Preparare le cellule per Immagini dal vivo
- Coltura cellulare e la semina
- Utilizzare le cellule MCF-7 di tumore mammario selezionate per la resistenza a docetaxel (MCF-7 TXT) e la loro linea cellulare dei genitori non resistente (MCF-7 CC). Il processo di selezione dettagliata e la caratterizzazione di queste linee cellulari selezionate sono state descritte in precedenza 24.
- Grow tutte le cellule in coltura 10 cm a 37 ° C in un mezzo costituito 90% del mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) e il 10% di siero fetale bovino (FBS) e integrati con amminoacidi non essenziali. Mantenere il mezzo in CO 2 atmosphere 5%. Mantenere le cellule MCF-7 TXT a 5 nM docetaxel.
- cellule seme su vetrini per l'imaging dal vivo. Sterilizzare 24 mm vetrini poli-L-lisina rivestite risciacquandole con il 70% di alcol e poi esporli ai raggi UV durante la notte. Mettere i coprioggetti in una piastra di coltura 6 pozzetti di 35 mm. Plasso un vetrino in ciascun pozzetto.
- Rimuovere il mezzo dal piatto di coltura di 10 cm e lavare le cellule con PBS. Aggiungere 0,5 ml di tripsina-EDTA al piatto per staccare le cellule dal piatto. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura al piatto di neutralizzare la tripsina dopo il distacco delle cellule.
- Contare le cellule con un emocitometro per determinare il numero di cellule per unità di volume.
- Aggiungere circa 10 5 cellule in ciascun pozzetto in base al numero di cellule per unità di volume. Dopo aver agitato delicatamente, mettere la piastra posteriore in incubatrice per permettere alle cellule di allegare alle lamelle.
- L'espressione di GFP-tagged α-tubulina
- Per saggiare dinamica dei microtubuli, trasdurre le cellule con GFP-tagged α-tubulina con il controllo di trasduzione GFP commerciale (ad esempio, BacMam) secondo il protocollo del produttore.
- Cultura le cellule nel pozzo per 36 h in un incubatore a 37 ° C coltura cellulare per consentire comadesione completo e il 60% di confluenza.
- Calcolare il volume appropriato di GFP-tagged α-tubulina aggiungere a ciascun pozzetto, secondo la seguente equazione:
Il numero di cellule è il numero totale stimato di cellule nel pozzo al momento dell'etichettatura e PPC desiderato è il numero di particelle per cella.
NOTA: Semina le cellule MCF-7 va raddoppiato il numero di celle da 10 5 2 x 10 5 con un PPC desiderata del 20, il volume necessario per ogni vetrino è quindi di 40 microlitri. Per le cellule differenti, il volume calcolato sulla base della formula di cui sopra non può essere la migliore. Il volume esatto deve essere regolata in base al livello di espressione reale di GFP-tubulina. - Mescolare le alfa-tubulina più volte GFP-etichettato per inversione per garantire una soluzione omogenea. Non farlo vortice.
NOTA: Per il controllo, la (controllo) reagente Null manca di qualsiasi genetica dei mammiferielementi e possono essere usati per aiutare a determinare i potenziali effetti baculovirus-mediata e fluorescenza di fondo. Un controllo di trasduzione non mirati GFP può anche essere utilizzato, che si illuminerà l'intera cella. - Sostituire il terreno di coltura con terreno fresco. Aggiungere 2 ml del nuovo mezzo e 40 ml di GFP-tagged α-tubulina in ciascun pozzetto.
- Agitare delicatamente la piastra per permettere la completa miscelazione di GFP-tagged α-tubulina con il terreno di coltura. Riportare la piastra alla cultura incubatore e incubare per 24 ore per permettere l'espressione di GFP-tubulina.
- Trattare le cellule con docetaxel
NOTA: Questo esperimento è quello di testare l'effetto di docetaxel in microtubuli instabilità dinamica. Così, le cellule vengono trattate con la concentrazione desiderata di docetaxel.- Preparare un mezzo composto 90% di DMEM e il 10% di FBS e completato con amminoacidi non essenziali. Utilizzare DMEM senza rosso fenolo perché rosso fenolo può interferire con la fluorescence di GFP-tubulina. Aggiungere la concentrazione desiderata di docetaxel (da 10 nM a 10 pM). La soluzione madre di docetaxel è di 10 mm di dimetilsolfossido (DMSO).
- Pre-riscaldare il mezzo docetaxel a 37 ° C in incubatore di coltura tissutale.
- Sostituire il terreno di coltura normale con il mezzo contenente docetaxel e incubare per 30 minuti nel tessuto culturale incubatore. Ci dovrebbe essere almeno 3 lamelle per pozzetto per ciascuna concentrazione docetaxel.
2. l'imaging dal vivo per esaminare microtubuli instabilità dinamica
- Impostazione del sistema
- Eseguire esperimenti in una camera mantenuta a 37 ° C e 5% CO 2. Acquisire immagini di fluorescenza dal lasso di tempo di un sistema microscopico dotato di 60X, 1.42 olio NA lente obiettivo su un microscopio a fluorescenza invertito e con una telecamera CCD.
- Impostare le cellule per l'imaging dal vivo. Pre-caldo sia il titolare del campione eil mezzo a 37 ° C. Scegliere un vetrino da esaminare. Montare il vetrino di interesse su un porta-campioni e incubare con 1 ml del mezzo contenente docetaxel preparato al punto 1.3.1.
- Immagini dal vivo di microtubuli instabilità dinamica
- Identificare le celle che verranno utilizzati per l'imaging. Essi dovrebbero essere piatta, hanno una elevata intensità di fluorescenza di espresso GFP-tubulina, e hanno strutture microtubuli chiare.
- Scegliere una cella dal gruppo di cellule identificate dal punto 2.2.1 di esaminare prima. Focus sulla superficie periferica della cella identificata. Impostare il programma per il tempo di esposizione e la frequenza di acquisizione delle immagini. Mentre il tempo di esposizione è di solito di 0,5 s, le immagini saranno acquisite ogni due s.
- Lasciare un ulteriore 20 minuti per i passi da 1,33 a 2.2.3. Così, esattamente 50 minuti dopo l'aggiunta del docetaxel, come descritto al punto 1.3.3, avviare l'imaging (questo è per la standardizzazione).
- Registrare il microtubulo dynamics per 2 minuti, scattare una foto ogni 2 s. In totale, acquisire 60 immagini per la cella identificata.
- Passare alla successiva cella identificata e ripetere i passaggi 2.2.2 a 2.2.4. Ripetere la procedura fino a 5 celle sono state ripreso. È indispensabile farlo prima del tempo raggiunge 70 min dopo l'aggiunta del docetaxel, come descritto al punto 1.3.3.
- Per ogni condizione di trattamento, ripetere i passaggi da 2.2.1 a 2.2.5 per 3 diverse lamelle. In totale, immagine 15 celle, che è abbastanza dati per misurare microtubuli instabilità dinamica.
3. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati
- Deconvoluzione di immagini
- Deconvolve le immagini acquisite per ottenere una qualità elevata. Aprire il programma deconvoluzione equipaggiato con il sistema del microscopio.
- Fai clic su "Processo" e selezionare "Deconvolve." Trascinate il file immagine nella finestra "Input" e fare clic su "Do." Il file di immagine verrà deconvolved, ed ilfile di deconvolved verrà salvato come un nuovo file automaticamente.
- Generazione di video
- Fare clic sul file immagine deconvolved da aprire con il software attrezzato.
- Fai clic su "File" e selezionare "Salva come film". Selezionare il "formato di un film" come "AV" e lo "stile di animazione" come "Forward". Impostare la "qualità di compressione" a "100%" e il "frame rate" a "5 / secondo."
- Selezionare la casella di "animare attraverso il tempo" e fare clic su "Do it". Il video verrà generato.
- Misura di microtubuli accorciamento e tasso di crescita
- Identificare i microtubuli che verranno utilizzati per la misurazione. Per ogni cella, solo pochi microtubuli potranno avere il loro accorciamento o di crescita seguiti chiaro e completo.
- Esaminate ogni frame del video per identificare il fotogramma che mostra la lunghezza iniziale del microtubulo unND il telaio con il microtubulo più estesa o ridotta. Misurare la variazione di lunghezza tra i due microtubuli e il tempo trascorso tra i due telai.
- Calcolare il tasso di crescita o accorciamento dividendo la variazione di lunghezza per tempo (l'unità è micron / s). Per ogni condizione di trattamento, seguire almeno 10 cellule e misurare almeno 20 microtubuli.
- Calcolare la media e l'errore standard per ogni condizione di trattamento. Analizzare la differenza statistica tra le condizioni utilizzando il test di Student. Riportare i dati in una tabella e / o in un grafico.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo presentato qui, abbiamo studiato gli effetti del docetaxel sulla dinamica dei microtubuli del normale (MCF-7 CC) e docetaxel-resistente (MCF-7 TXT), le cellule del cancro al seno. Due serie di immagini mostrano gli effetti di docetaxel (0,5 mM) sulla crescita microtubuli e accorciamento in MCF-7 CC e MCF-7 TXT cellule (Figura 1A).
Abbiamo inoltre calcolato il tasso di crescita dei microtubuli o accorciando in queste condizioni per le due linee di cellule e ha dimostrato che a 0,5 micron, docetaxel inibisce fortemente la dinamica tubulina di cellule MCF-7 CC ma non cellule MCF-7 TXT (Figura 1B).
Figura 1: Gli effetti di docetaxel sulla microtubuli dinamicas di MCF-7 TXT e MCF-7 cellule CC. L'imaging dal vivo è stata eseguita come descritto. (A) Le immagini selezionate dalla immagini dal vivo della dinamica dei microtubuli in MCF-7 CC e le cellule MCF-7 TXT in seguito al trattamento con 0,5 mM docetaxel per 1 ora. La freccia indica i microtubuli si estendono. La freccia indica i microtubuli accorciamento. Dimensioni bar = 5 micron. (B) Il tasso di estensione e la velocità di accorciamento dei microtubuli sono stati misurati dalle immagini registrate. Ogni dato è la media di 20 misurazioni da almeno 8 celle diverse. La barra di errore è l'errore standard. ** Indica che la differenza è statisticamente significativa con p <0,01. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono due metodi principali per misurare microtubuli instabilità dinamica: in vitro e in vivo. Nel metodo in vitro, tubulina purificato viene utilizzato per misurare instabilità dinamica dei microtubuli con time-lapse microscopia a interferenza differenziale contrasto informatica avanzata. Nel metodo in vivo, microiniettato tubulina fluorescenti, o espresso GFP-tubulina, è incorporato in microtubuli. La dinamica (crescita e accorciamento) dei microtubuli vengono quindi registrati da time-lapse utilizzando una telecamera sensibile nella regione periferica delle cellule interfase 10, 20, 25. Mentre vari tipi di microscopi sono stati utilizzati a questo scopo, il protocollo abbiamo riportato qui usa un microscopio deconvoluzione.
In vivo, l'instabilità dinamica si verifica solo in microtubuli più estremità (estremità con la β-tubulina rivolta verso l'esterno), mentrei meno estremità (estremità con la α-tubulina rivolto verso l'esterno) rimangono la stessa lunghezza 26. D'altra parte, per microtubuli assemblati in vitro, instabilità dinamica avviene a entrambe le estremità dei microtubuli, con le estremità più essendo più robusto del minus termina 27. Il vantaggio principale di analizzare instabilità dinamica in vitro è che fornisce informazioni meccanicistiche sul ruolo specifico di diversi agenti sulla dinamica dei microtubuli in assenza di MAP cellulari. Inoltre, in condizioni in vitro, instabilità dinamica può essere studiata ad entrambe le estremità. Questo permette di comprendere meglio i meccanismi con cui farmaci o proteine regolatrici influenzano la stabilità dei microtubuli alle estremità opposte. Storicamente, le estremità meno sono tracciati molto meno del più finisce 10. Gran parte della nostra comprensione del comportamento dei microtubuli viene da studi su microtubuli assemblati da tubulina purificato in vitro. Tuttavia, mentre molti dei principi fondamentali di comportamento dei microtubuli ottenuti da questi studi può essere applicato anche ai microtubuli nelle cellule, ci sono alcune differenze nella dinamica dei microtubuli tra in vitro e in vivo. Nelle cellule, microtubuli spesso crescono a un cinque a dieci volte tasso più veloce, e le transizioni tra crescita e / o accorciamento verificano ~ 10 volte più frequentemente che con microtubuli assemblati da tubulina purificato in vitro. Ci sono anche drammatici cambiamenti nell'organizzazione dei microtubuli e le dinamiche di tutto il ciclo cellulare, che riflettono un alto grado di regolamentazione spaziale e temporale del comportamento dei microtubuli cellulari. Questo comportamento non può essere studiato dalla ricerca in vitro. Inoltre, la regolazione della dinamica dei microtubuli si ottiene tubulina modificazione post-traslazionale, espressione tubulina isotipo, e un folto gruppo di mappe e altre proteine microtubuli interagenti che o stabilizzare o destabilizzare microtubuli 28, 29. Pertanto, lo studio dei microtubuli instabilità nelle cellule viventi è molto più fisiologico applicabile.
Il metodo qui descritto è un protocollo semplice e molto affidabile per studiare la dinamica microtubuli nelle cellule viventi. I passi che richiedono maggiore attenzione sono la selezione della cella di osservazione e la determinazione del tempo di esposizione. E 'fondamentale per selezionare le celle che sono piatti e hanno alta intensità di fluorescenza di GFP-tubulina. E 'anche desiderabile ridurre l'intensità di eccitazione e il tempo di esposizione per evitare la dissolvenza della fluorescenza GFP. Certo, come tutti gli altri metodi in vivo, questo protocollo non è adatto per lo studio dei microtubuli instabilità dinamica in varie condizioni manipolati. Per esempio, diverse isoforme di α- e β-tubulina possono comportarsi in modo diverso in termini di dinamica dei microtubuli. Solo metodi in vitro può essere utilizzato per study gli effetti delle singole isoforme tubulina purificato su microtubuli instabilità dinamica. Inoltre, rispetto alla microiniezione di tubulina fluorescenza marcato, l'espressione di GFP-tubulina etichettato mediante trasfezione o trasduzione di plasmidi può presentare una relativamente bassa rapporto segnale-rumore. Tuttavia, l'espressione di tubulina GFP-tagged in cellule di trasfezione o trasduzione di plasmidi permette maggiore libertà di modificare sperimentalmente altre caratteristiche cellulari.
Il protocollo qui riportato può essere utilizzato per vari studi. Da un lato, può fornire spunti nuovi e critici relativi alla funzione di microtubuli durante le varie fasi del ciclo cellulare, in particolare nella mitosi. Può anche essere usato per studiare gli effetti di vari processi cellulari, come la migrazione, sulla dinamica dei microtubuli. D'altra parte, può essere usato per studiare gli effetti di vari inibitori microtubuli (molti dei quali sono farmaci antitumorali) sulla dinamica dei microtubuli in normale ele cellule cancerose in condizioni più fisiologiche. Abbiamo usato questo metodo per studiare gli effetti dei vari farmaci anti-cancro mitotico sulla instabilità dinamica dei microtubuli in entrambe le cellule resistenti e cancro al seno resistente non docetaxel docetaxel.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
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