Introduction
In de afgelopen decennia is de extracellulaire matrix (ECM) wordt erkend als een gevarieerde, dynamische en complexe omgeving die betrokken is bij meerdere cel-fysiologische en pathologische processen. Op het weefsel niveau, de ECM beïnvloedt cell signaling, beweeglijkheid, differentiatie, angiogenese, stamcel biologie, het ontstaan van tumoren, fibrose, etc. 1,2. De studie van ECM organisatie en ECM-afhankelijke processen heeft dus grote gevolgen voor de celbiologie en weefsel fysiologie. Een mechanistisch begrip van ECM samenstelling, organisatie en functionele eigenschappen bereikt worden werkwijzen voor de nauwkeurige isolatie van ECM vereist. Overwegende dat de eerste identificatie van de ECM eiwitten ingeroepen isolatie van weefsels 3, heeft de voorbereiding van de ECM uit gekweekte cellen inmiddels vaker.
De isolatie en analyse van cellen afgeleide ECM is ingewikkeld om twee belangrijke redenen. Enerzijds, de aanwezigheid van cellen en deir overvloedige intracellulaire eiwitten kan het moeilijk maken om de ECM te isoleren als discrete extracellulaire structuur. Inderdaad Sommige ECM eiwitten rollen in de cel en in de ECM 4; derhalve de efficiënte verwijdering van intracellulaire eiwitten uit cellen afgeleide ECM is essentieel als de studie van eiwitten in de ECM niet te verwarren met hun rollen in de cel. Ten tweede wordt de cel afkomstige ECM uit vele grote, oligomere eiwitten, die vaak covalent verknoopt aan ECM assemblage en derhalve onoplosbaar in standaard reinigingsmiddelen. Deze eigenschappen kunnen opvragen en verdere analyse van ECM bemoeilijken. Om deze problemen aan te pakken, is een werkwijze vereist die de efficiënte scheiding van ECM eiwitten uit cellulaire componenten mogelijk maakt.
Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor de isolatie van ECM van zowel celkweek of weefselextracten. Veel van deze methoden gericht op de winning van de overvloedige ECM protein, collageen, uit weefsels en omvatten het gebruik van neutrale zouten 3, zure omstandigheden 5,6 of pepsine 7. Isolatie van totale ECM uit weefselextracten gaat vaak cellen ontdoen van het weefsel voorafgaand aan de isolatie van de ECM. Zo heeft een sequentiële extractie methode beschreven dat ECM uit menselijk hartweefsel 8 isolaten. Eerst werden losjes gebonden ECM eiwitten geëxtraheerd met 0,5 M NaCl voor natriumdodecylsulfaat (SDS) werd gebruikt om de cellen te verwijderen. Tenslotte werden de resterende ECM eiwitten geëxtraheerd middels 4 M guanidine 8. ECM kunnen ook oplosbaar worden gemaakt van cellen ontdane mbv 8 M ureum 9. Andere technieken detergenten, zoals deoxycholinezuur 10, zowel cellen en ECM extraheren voordat scheiden onoplosbare ECM eiwitten uit de oplosbare cellysaat door centrifugatie.
De werkwijze voor isolatie en analyse van cellen afgeleide ECM in dit rapport beschreven is, een reproduceerbare werkwijze voor het verwijderen van celmateriaal, waardoor cellen afgeleide ECM die door in situ immunofluorescentie kunnen worden geanalyseerd of verwijderd voor verdere biochemische analyse. Deze methode kan worden aangepast voor alle aanhangend celtype en kan worden opgeschaald voor stroomafwaartse procedures, zoals immunoblotting of massaspectrometrie, of gebruik van het geïsoleerde ECM functionele studies. De werkwijze kan ook worden gebruikt in combinatie met confocale microscopie van levende cellen om ECM afzetting van een gemerkt eiwit van interesse in real time volgen. Dit wordt bereikt door het gebruik van een gerasterde glazen bodem schaal. Kortom, de aanpak een nauwkeurige isolatie van cellen afgeleide ECM en ook de omvang opsporen en volgen de afzetting en dynamica van individuele ECM eiwitten.
Protocol
1. Verwijdering van Cellen met ammoniumhydroxideoplossing
- Bereid hechtende cellen door Plating in de juiste dichtheid.
LET OP: De cellen kunnen alle aanhangend celtype dat er voldoende ECM produceert voor analyse. Hier beschrijven we het gebruik van COS-7-cellen, Afrikaanse groene aap nier fibroblast-achtige cellijn die SV-40 virus-DNA-sequenties bevat; RCS, een rat chondrosarcoom cellijn; of normale menselijke dermale fibroblasten (HDF) stammen uit juveniele voorhuid. HDF gebruik van passage 1 tot enige passage 8.- Plaat de cellen op dekglaasjes voor beeldvorming van levende cellen en de ECM, fluorescentiemicroscopie studies van vaste ECM of voor de bereiding van cellen afgeleide ECM kleinschalige functionele bepalingen. Plate de cellen op celkweek gerechten voor SDS-PAGE-analyse, immunoblot of proteomics studies.
OPMERKING: De celkweekomstandigheden (aantal cellen aan de plaat en kweekmedium) zal afhangen van het celtype. Het aantal cellen tot op het bord zal moetenempirisch worden vastgesteld voor de bepaalde cellijn of cellijn. - Maken een geschikte tijd om de cellen te deponeren ECM, meestal> 16 uur. OPMERKING: De tijdsperiode hangt af van het celtype en moet empirisch worden bepaald. Indien bij ectopische expressie, zodat passende tijd voor de expressie van de getransfecteerde eiwit van belang en voor de afzetting van ECM.
- Plaat de cellen op dekglaasjes voor beeldvorming van levende cellen en de ECM, fluorescentiemicroscopie studies van vaste ECM of voor de bereiding van cellen afgeleide ECM kleinschalige functionele bepalingen. Plate de cellen op celkweek gerechten voor SDS-PAGE-analyse, immunoblot of proteomics studies.
- In een afzuigkap, Bereid 20 mM ammoniumhydroxide in een geschikt vat door verdunning van de Stock Solution 1/14 met gedeïoniseerd H 2 O.
- Verwijder de cellen van de incubator en verwijder voorzichtig kweekmedium. Add fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + / Mg2 + door langzaam gieten tegen de wanden van de schaal. Rock de schotel twee keer en verwijder de vloeistof met een plastic overdracht pipet. Herhaal dit nog twee keer.
- In een afzuigkap, kantelen elk gerecht en verwijder de PBS uit stap 1.2 met een plastic overdracht pipet. Voeg 3mL ammoniumhydroxide per 100 mm schaal en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Gedurende de 5 min incubatieperiode voorzichtig schudden de schotel elke min aan de lyse van de cellen te waarborgen. Stappen 1,4-1,7 zal ook in de afzuigkap worden uitgevoerd.
OPMERKING: Alternatieve verwijdering cel reagentia omvatten 2 M en 8 M ureum, die zijn geïncubeerd met de cellen gedurende 10 min. - Voeg overvloedige hoeveelheden gedeïoniseerd H2O elk gerecht, tenminste 20 ml per 100 mm schaal met schommelen. Gooi de ammoniumhydroxide-oplosbaar materiaal-dat uit ammoniumhydroxide, gelyseerde cellen en gedeïoniseerd H2O-door afzuigen met een transferpipet. Breng deze oplossing afval in een container voor vloeibaar afval.
- Was de onoplosbare ECM laag in overvloedige gedeïoniseerd H2O vier keer om de volledige verwijdering van de ammoniumhydroxide-oplosbaar materiaal te waarborgen.
- Voor het onderzoek van de ECM door immunofluorescentie, bevestig de ECM door toevoeging van 2%paraformaldehyde (PFA, 3 ml per 100 mm schaal) bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
Let op: PFA is zeer gevaarlijk in geval van de huid of ogen en ernstige overbelichting kan longschade, verstikking, bewusteloosheid, of de dood veroorzaken. Het mag alleen worden behandeld in een afzuigkap en persoonlijke beschermingsmiddelen moeten gedragen worden. - Was elk vaste monster tweemaal met PBS, zoals in stap 1.2, en gooi de PFA-oplossing in een geschikte bak vloeibaar afval. Indien nodig maakt ECM monsters in PBS bij 4 ° C voor te bereiden op fluorescentie microscopie.
2. Tracking Afzetting van een ECM-eiwit door confocale microscopie beeldvorming van levende cellen
- Tel de cellen onder een hemocytometer. Voor COS-7-cellen, plaat 250.000 cellen op een 60 mm celkweek schotel voor transfectie.
Opmerking: Voor live cell imaging, moeten de cellen worden getransfecteerd met een vector die codeert voor het ECM eiwit van belang gefuseerd in frame met een genetisch gecodeerd fluorescerennt tag. Dit is de identificatie van de ECM eiwit van belang bij live-cell imaging inschakelen. - Na een geschikte tijd voor proteïne-expressie (bijvoorbeeld 16 uur) te verwijderen van de cellen van de schaal met trypsine-EDTA-oplossing, ze tellen in een hemocytometer en plaat ~ 150.000 cellen op een 35-mm gerasterde, glazen bodem schotel voor beeldvorming. Laat 2 uur om de cellen weer vast en ECM afzetting beginnen (de tijdsperiode is afhankelijk van het celtype en dient empirisch te worden vastgesteld).
LET OP: Gebruik een cel medium dat geen fenolrood bevat, omdat deze een rode tint die de beeldkwaliteit beïnvloedt kan geven. - Tijdens de bovengenoemde periode van 2 uur, het opzetten van een confocale microscoop met een 37 ° C incubator kamer en een CO2-levering. Hierdoor kan de temperatuur in de kamer en in de schaal te stabiliseren tot 37 ° C voor de beeldvorming; Dit kan tot 1 uur.
- Incubeer de cellen uitgeplaat op de 35 mm gerasterde schotel met een fluorescerende cel marker voor 30 min. Vervolgens was de cellentweemaal in fenolrood-vrij kweekmedium voorafgaand aan beeldvorming.
OPMERKING: Een cytoplasmatisch fluorescente merker kan worden gebruikt om celvolumes visualiseren of een membraan waarin marker kan worden gebruikt om celranden visualiseren. - Met behulp van de 20X objectief en fase contrast op een confocale microscoop, identificeren een geschikte raster plein dat een aantal (> 3) hechtende, gezonde cellen bevat. Bevestigen de expressie van het doeleiwit keuze in de cellen in de geselecteerde rastervak met de doelstellingen 63X en 100X en de juiste golflengtes onder fluorescentiemicroscopie.
- Opzetten fluorescentie en fase-contrast time-lapse beeldvorming met behulp van een z-stack software. Stel de "begint" stack net onder de ECM laag en het "einde" stack om net boven het cellichaam. Stel de z-stapgrootte 0,3 urn en de z-volume tussen 5 en 10 urn diepte in totaal, afhankelijk van het celtype. Dit zal tussen de 15-30 z-profielen per tijdstip geven.
- Capture fluorescentie (voor rood fluorescerend eiwit (RFP), excitatie = 555 nm en emissie = 584 nm) en fase-contrast beelden periodiek over een bepaalde periode. Gebruik bijvoorbeeld de time-lapse-software om het tijdsinterval op 2 min en de duur tot 2 uur in te stellen. Selecteert u de knop "start" om het vastleggen van z-sectie beelden beginnen over de gedefinieerde periode.
- Aan het einde van de periode, verwijderen van de cellen van schotel, zoals beschreven in stappen 1.1-1.5, de lokalisatie van de fluorescent gemerkt eiwit van interesse in de ECM bevestigen.
- Gebruik fase-contrast beeldvorming en de 20X objectief te verhuizen de desbetreffende raster plein.
- Overschakelen naar het 63x objectief en identificeren van de ECM laag onder fluorescentie microscopie. Vergelijk dit beeld Het beeld van de pre-winning tot
3. Steriele Voorbereiding van de Cell-afgeleide ECM for Cell functionele testen
- Grow een populatie van cellen (de "matrix producent" cellen) op dekglaasjes en andere popuordening (de "test" cellen) in standaardkweek in een 100 mm kweekschaal cel ten minste 24 uur.
Opmerking: Dit kunnen twee verschillende hechtende celtypen en proefopzet kunnen omvatten transfectie van één of beide celpopulaties een fluorescent-gelabelde ECM-eiwit tot expressie. - In een laminaire stroming kap, zoals gebruikt voor celkweek, voor te bereiden steriele oplossingen van PBS zonder Ca 2+ / Mg 2+, 20 mM ammonium hydroxide (zie stap 1.3), en de-geïoniseerde H 2 O door het passeren van elk door een steriel 0,2 um filter in een geschikte steriele container.
- Het handhaven van steriele techniek, voorzichtig te wassen de "matrix producent" cellen op dekglaasjes drie keer met steriele PBS (zie stap 1.2).
- Verwijder de PBS door aspiratie met een steriele pipet en gooi het in een geschikte houder vloeibaar afval. Voeg 20 mM steriel ammoniumhydroxide (3 ml / 100 mm schaal) en incubeer ze gedurende 5 minuten met tussenpozen schommelen.
- Voeg grote hoeveelhedensteriel gedeïoniseerd H 2 O aan de "matrix producent" schaal, ten minste 20 ml per 100 mm schaal, met schommelstoelen, en giet weg het cellysaat in een geschikte afvalcontainer.
- Herhaal stap 3,5 vier keer om de volledige verwijdering van de ammoniumhydroxide-oplosbaar materiaal te waarborgen.
LET OP: De ECM door de "matrix producent" cellen afgezet op de dekglaasjes biedt dan een steriele ECM voor functionele assays met enige testcellen van belang. - Incubeer de testcellen uit de cel stock schaal met 1,5 ml trypsine-EDTA-oplossing per 100 mm schaal (0,05% w / v trypsine en 0,02% w / v EDTA in gebalanceerde zoutoplossing Hank's) tot de testcellen worden losgemaakt van de schotel . Voeg cel medium, centrifuge de test cellen op 400 xg gedurende 5 minuten, en verwijder de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer de testcellen in vers, steriel medium en tellen in een hemocytometer. Plate een passend aantal van deze testcellen op de steriele, geïsoleerde ECM op coverslips. Cultuur hen in de juiste cel medium voor 2-3 uur, of voor de tijd die nodig is voor de experimentele opzet.
- Om de organisatie van het actine cytoskelet te onderzoeken, bevestig de testcellen in 2% PFA en vlekken ze met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) -phalloidin (excitatie = 490 nm en emissie = 525 nm) te visualiseren F-actine en met 4 ', 6 -diamidino-2-phenylindole (DAPI; excitatie = 358 nm en emissie = 461 nm) om de kernen 11 te visualiseren.
Opmerking: Vergelijk de morfologie en actine organisatie in de test cellen op heterologe cellen afgeleide ECM met testcellen uitgeplaat op hun ECM.
4. Isolatie van ECM voor SDS-PAGE, immunoblotanalyse of Proteomics
- Grow hechtende cellen van de rente op 100 mm celkweek gerechten (5-10 gerechten voor proteomics of 1-2 gerechten voor immunoblotting) voor 24-96 uur, afhankelijk van het celtype, om secretie en afzetting van ECM mogelijk te maken.
- Verwijder de cellen als descrIBED in stappen 1,1-1,5.
- Kantelen elke plaat een hoek om resterende H 2 O afvoer aan de bodem van de schaal, en verwijder alle resterende H 2 O met een p200 pipet totdat de plaat volledig droog.
- Tegelijkertijd warmte SDS-PAGE monsterbuffer bevattende 100 mM dithiothreitol (DTT) tot 95 ° C gedurende 2 minuten met een verwarmingsblok en vervolgens toevoegen aan de plaat. 200 pl monsterbuffer per 100 mm plaat is geschikt voor monsters met immunoblot te onderzoeken.
- ECM door massaspectrometrie geanalyseerd, bereiken een meer geconcentreerde monster door het verzamelen van de SDS-PAGE monsterbuffer van de schaal (zoals beschreven in stap 4.5 en 4.6, hieronder), opnieuw te verwarmen tot 95 ° C, en met dezelfde hoeveelheid in 2-3 extra schotels.
- Gebruik een cel schraper om grondig te schrapen de ECM uit de schotel, ervoor te zorgen dat alle gebieden van het gerecht zijn geschraapt.
- Met celschraper verzamelen van het monster aan een kant van de schaal en verwijderen met een 200pi pipetpunt in een buis.
- De eventueel achtergebleven SDS-PAGE monsterbuffer uittreksel uit de cel schraperuiteinde in de buis om het verlies van ECM materiaal te minimaliseren. Voor een geconcentreerd monster, re-verwarmen hetzelfde SDS-PAGE sample buffer monster tot 95 ° C en opnieuw te gebruiken het over 2-3 extra borden.
- Los het ECM eiwitten door SDS-PAGE 12, met behulp van 7% of 4-7% gradiënt polyacrylamide gels.
LET OP: Het is handig om pre-lood eiwit markers te gebruiken. - De resolutie van het hoge molecuulgewicht ECM eiwitten, het beleid gel looptijd zodanig dat de 37 kDa molecuulgewicht merker loopt dicht bij de bodem van de gel en molecuulgewichtsmerkers <37 kDa werking van de gel.
- Voor proteomics analyse van ECM eiwitten, vlekken op de gel met een eiwit vlek en vastleggen van een beeld. Snijd banden van interesse van de gel, verteren ze met trypsine en analyseren door matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) -massa spectrometrie <sup> 13.
- Als alternatief voor een meer uitgebreide analyse van de ECM-extract en het gehele monster te analyseren, snijd de gel laan in secties, verteren ze met trypsine, en het uitvoeren van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) 14.
- Als alternatief voor immunoblotting 15, transfer eiwitten van de SDS-PAGE gel op polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan bij 15 V gedurende ten minste 1 h 10 min (semi-droge methode) de overdracht van het hoge molecuulgewicht ECM eiwitten garanderen . Visualiseren het totale eiwit overgebracht naar het membraan met Ponceau S kleuring.
- Na stap 4.11, gebruikt antilichamen om de aanwezigheid vast te stellen en / of een semi-kwantitatieve analyse van de individuele ECM eiwitten 15.
- Blokkeer het membraan met 2% (w / v) melk in TBS-Tween 20 (blokkerende buffer) overnacht bij 4 ° C. Verdun specifieke antilichamen ECM eiwitten in blokkerende buffer en geïncubeerd met het membraan gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur (antilichaam tegen fibronectin verdund 1/600 en antilichaam tegen thrombospondin-1 verdund 1/150; Aanvullende Tabel 1).
- Test de kwaliteit van de ECM isolatie door het opnieuw sonderen dezelfde blot met antilichamen tegen overvloedige intracellulaire proteïnen, zoals actine en tubuline (anti-actine verdund 1 / 10.000 en anti-tubuline verdund 1/5000).
Representative Results
De beschreven protocol stappen 1,1-1,5 handelingen om cellen te verwijderen en achter de cel afkomstige ECM. Het protocol werd uitgevoerd op COS-7-cellen gekweekt gedurende 96 h op dekglaasjes uitgevoerd en de cellen afgeleide ECM werd geanalyseerd met fluorescentiemicroscopie. Het ammoniumhydroxide behandeling verwijderd doeltreffend de cellen, zoals vastgesteld door het verlies van de celkernen en actine cytoskelet volgens DAPI kleuring en phalloidin respectievelijk (figuur 1). De extractie van cellen met 2 M ureum was niet zo effectief als ammoniumhydroxide; sporen en DAPI kleuring phalloidin werden gedetecteerd na behandeling. 8 M ureum had hetzelfde effect als ammoniumhydroxide (figuur 1). Vervolgens werd de cel afkomstige ECM zichtbaar voor en na de behandeling ammoniumhydroxide (stappen 2,1-2,11). COS-7-cellen werden getransfecteerd met een monomere fluorescerende proteïne (mRFP) gemerkte thrombospondine-1 C-terminale trimeer (mRFPovTSP1C) 11 en gekweekt op een 35 mm schotel met een gerasterde glazen voet.
Twee uur na de plating, een geschikte raster vierkante die meerdere gezonde cellen die mRFPovTSP1C bevatte werd gevisualiseerd onder een confocale microscoop. Image Een verwijzing fase contrast werd genomen van dit gebied, en vervolgens fluorescentie time-lapse imaging werd elke 1 min 2 uur (Figuur 2A) uitgevoerd. Cellen werden vervolgens verwijderd met ammoniumhydroxide en dezelfde rastervak op de schotel is verplaatst onder fasecontrast en vervolgens opnieuw geanalyseerd door fluorescentie microscopie. De cellen waren niet meer aanwezig in het raster plein, maar mRFPovTSP1C bleven binnen de ECM, gedetecteerd door fluorescentie microscopie als kenmerkend puncta (Figuur 2A). Elke mRFPovTSP1C afgezet in de ECM vóór verwijdering cel werd geïdentificeerd door vergelijking van de fluorescentie patroon voor en na verwijdering van cellen. De fluorescerende puncta die in beide beelden (Figure 2A, bijvoorbeeld pijlen) worden afgeleid geassocieerd met de ECM.
Ammoniumhydroxide behandeling werd vervolgens gebruikt om natieve ECM isoleren uit gekweekte, hechtende cellen. Menselijke dermale fibroblasten (HDF) werden gekweekt op dekglaasjes gedurende 96 uur. De cellen werden verwijderd met ammoniumhydroxide en de ECM werd gesondeerd met een anti-collageen I antilichaam, dat een karakteristiek fibrillair en meshwork kleuringspatroon 16 (figuur 2B) aangetoond. Fibronectine patroon werd onderzocht rond vaste, niet-gepermeabiliseerde cellen chondrosarcoma rat (RCS) en in de ECM na het verwijderen van de RCS-cellen (Figuur 2C). De ammoniumhydroxide isolatie van ECM werd ook uitgevoerd onder steriele omstandigheden uitgevoerd zodat "test" cellen kunnen opnieuw worden verzilverd op de ECM voor fenotypische of functionele studies. Bijvoorbeeld, "test" COS-7 cellen werden gedurende 2 uur op steriele ECM door RCS cellen en tanneer zij werden vastgesteld, permeabel gemaakt en geanalyseerd op F-actine organisatie door FITC-phalloidin kleuring in vergelijking met COS-7 cellen die hun ECM (stappen 3,1-3,9) (figuur 3).
Op grotere schaal, werd de methode voor ECM isoleren biochemische. Zo werden RCS cellen gekweekt op twee 100 mm celkweek gerechten voor 7 dagen, en de procedures in de stappen 4,1-4,7 werden gevolgd. Eiwitten in de cel afkomstige ECM werden verzameld door schrapen ze in hete SDS-PAGE monsterbuffer en werden gescheiden door SDS-PAGE op een 7% polyacrylamidegel onder reducerende omstandigheden. De gel werd gekleurd voor eiwit en de vier hoofdbanden werden elk geïsoleerd en geanalyseerd met massaspectrometrie (figuur 4A). Een aantal ECM eiwitten, waaronder fibronectine, thrombospondine 1 (TSP1), trombospondine 5 / kraakbeen oligomeer matrixproteïne (TSP5 / COMP) en matrilin-1 werden geïdentificeerd (Figuur 4B).
Als alternatief kunnen kleinschaliger bereidingen van ECM worden geëvalueerd door immunoblots. Bijvoorbeeld, cellen afgeleide ECM van COS-7 cellen die ectopisch tot expressie mRFPovTSP1C werd gescheiden door SDS-PAGE, overgebracht naar een PVDF membraan en onderzocht voor RFP met een anti-RFP antilichaam (Figuur 4C). Deze techniek is gevoelig genoeg om verschillen tussen met een natief trimeer van TSP1 (mRFPovTSP1C) en een aangelegde pentameer van het TSP1 C-eindstandige gebied (mRFP-TSP-5-1C) 17 (figuur 4C) detecteren. De endogene ECM van HDF onderzoeken, de aanwezigheid van specifieke eiwitten in cellysaat of geïsoleerde ECM werd onderzocht door immunoblotting. De kenmerkende ECM eiwitten fibronectine en thrombospondine-1 gedetecteerd in de ECM, terwijl de overvloedige intracellulaire eiwitten α-tubuline en β-actine afwezig het geïsoleerde ECM (Figuur 4D) waren.
Figuur 1: Vergelijking van manieren Cell verwijderen. COS-7-cellen werden bij hoge dichtheid gedurende 96 h op dekglaasjes, in 2% PFA gefixeerd en gepermeabiliseerd in 0,5% Triton X100, of behandeld zoals aangegeven voor celverwijdering. De dekglaasjes werden vervolgens gekleurd met FITC-phalloidin visualiseren F-actine en DAPI om kernen te visualiseren. Schaal bar = 25 pm. Dit cijfer wordt gewijzigd van een originele publicatie in het Journal of Cell Science 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Identificatie van ECM eiwitten in geïsoleerde ECM. (A) Fase-contrast en fluorescentie beelden vanCOS-7 cellen die mRFPovTSP1C en gekweekt op een 35 mm schaal met een doorzichtige bodem, gerasterde basis voor 2 uur. Beelden worden weergegeven voor en na de verwijdering van de cellen door ammoniumhydroxide. De rand van de letter rooster wordt in het fasecontrast beelden met een stippellijn. Witte pijlen geven voorbeelden van fluorescerende puncta die voor en na celverwijdering aanwezig waren. (B) Detectie van collageen I in HDF ECM door indirecte immunofluorescentie. HDF werden gedurende 96 uur en verwijderd met ammoniumhydroxide en de ECM werd gekleurd voor menselijk fibrillair collageen I. De ECM werd gekleurd met FITC-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam alleen. (C) Lokalisatie van fibronectine rond RCS cellen of in geïsoleerde RCS ECM, zoals gedetecteerd door indirecte immunofluorescentie. RCS cellen werden gedurende 48 uur in 2% PFA gefixeerd en gekleurd met DAPI en fibronectine. Parallel schotels werden cellen verwijderd met 20 mM ammoniumhydroxide en de ECM werd gekleurd voor fibronectin en met DAPI. Cellen werden gekleurd met FITC-geconjugeerd anti-muis IgG antilichaam alleen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het gebruik van steriel ECM voor functionele studies. RCS "matrix producerende" cellen werden gedurende 48 uur op glazen dekglaasjes en behandeld met 20 mM ammoniumhydroxide onder steriele omstandigheden om de cellen te verwijderen. COS-7 "test" cellen werden uitgeplaat op dekglaasjes met of zonder geïsoleerde RCS ECM gedurende 2 uur in 2% PFA gefixeerd, gepermeabiliseerd in 0,5% Triton X100 en gekleurd met FITC-phalloidin aan F-actine en DAPI om kernen te visualiseren visualiseren . COS-7 cellen op RCS ECM verspreid uitgebreider en vormden grote gloeidraad bundels (bijvoorbeeld pijlen) en de rand kemphaanles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Identificatie van eiwitten uit geïsoleerde ECM door SDS-PAGE, massaspectrometrie of immunoblotting. (A) RCS cellen werden gedurende 7 dagen en verwijderd met 20 mM ammoniumhydroxide; de ECM werd geschraapt omhoog in hete SDS-PAGE sample buffer met 100 mM DTT. De ECM preparaat werd gescheiden door SDS-PAGE op een 7% polyacrylamidegel onder reducerende omstandigheden. Vier significante banden (pijlen 1-4) geïdentificeerd door eiwitkleuring. (B) eiwitten van RCS ECM groepen 1-4 werden geïdentificeerd door MALDI massaspectrometrie. (C) COS-7 cellen die ofwel mRFPovTSP1C (trimeer) of mRFP-TSP-5-1C (pentameer) werden gedurende 48h en verwijderd met 20 mM ammoniumhydroxide en de ECM werd geïsoleerd in hete SDS-PAGE monsterbuffer bevattende 100 mM DTT. De ECM preparaat werd gescheiden door SDS-PAGE op een 7% polyacrylamidegel onder reducerende omstandigheden, overgebracht naar een PVDF membraan en gemerkt met een anti-RFP antilichaam. Dit paneel wordt gewijzigd van een originele uitgave in de bio-rapporten 17. (D) HDF werden gedurende 96 uur en vervolgens behandeld met ofwel 2% deoxycholzuur in PBS (cellysaat) of 20 mM ammoniumhydroxide om cellen te verwijderen. De ECM werd afgeschraapt in hete SDS-PAGE sample buffer. De twee fracties werden gescheiden door SDS-PAGE op een 10% polyacrylamidegel onder reducerende omstandigheden, overgebracht naar een PVDF membraan en gemerkt met antilichamen, zoals aangegeven. In elk paneel, worden de posities van molecuulgewichtsmerkers in kDa aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze fi bekijkenguur.
Discussion
Kritische stappen in het protocol
De methode heeft een aantal kritische stappen die moeten worden gevolgd om de succesvolle isolatie en analyse van ECM te waarborgen. Zo wordt ammoniumhydroxide gebruikt om de cellen te verwijderen en ECM isoleren voor analyse. Hoewel ammoniumhydroxide stabiel in waterige oplossingen in het donker en kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen, flessen moeten goed opnieuw gesloten tussen elk gebruik. Omdat het gas kan verdampen uit de oplossing, waardoor de concentratie verminderen, raden we starten van een frisse fles om de 6-8 weken. Bovendien moet de werkoplossing vers gemaakt voor elk experiment. Het is ook essentieel dat de cellen volledig zijn verwijderd met overvloedige wassingen in gedeïoniseerd water. Als deze stappen niet voldoende worden uitgevoerd, kan celmateriaal op de schotel blijven en vervuilen downstream analyses. Indien cellen werden gekweekt gedurende 10 dagen of langer, kan extra water wassingen nodig zijn. Het is belangrijk om noot dat de geïsoleerde ECM laag is typisch zeer dun in vergelijking met de cellen 11, dat zorg nodig is bij het identificeren van de ECM tijdens de beeldvorming. Voor doelmatige winning van de geïsoleerde ECM in SDS-PAGE monsterbuffer, is het essentieel dat de monster buffer bevat een reductiemiddel. Voor de meest effectieve verwijdering van de ECM, moet kokend hete monsterbuffer gebruikt. Voor experimenten waarbij ECM monsters worden opgelost door SDS-PAGE elektroforese voor eiwitkleuring of proteomics, is het essentieel om een geconcentreerd monster te bereiken door schrapen verschillende platen-waarde van ECM in dezelfde hoeveelheid monsterbuffer.
Wijzigingen en problemen oplossen
De productie en secretie van ECM eiwitten kan sterk variëren tussen celtypen, zodat termijnen voor secretie en afzetting van ECM moet de novo worden bepaald voor elk celtype. Het is ook belangrijk te weten dat ECM samenstelling dynamisch verandert met betrekking to celdichtheid en tijd in de cultuur 18. Deze factor moet rekening worden gehouden bij het ontwerpen experimenten. Is duidelijk dat de selectie van een celtype voor deze methode is belangrijk, vooral bij het uitpakken ECM voor analyse met massaspectrometrie, die een aanzienlijke hoeveelheid totale eiwitten ECM nodig.
Beperkingen van de Techniek
Cellen die zeer lage niveaus van ECM eiwitten uitscheiden extra uitdaging voor gebruik met deze methode. Niet-hechtende cellen, 3D celculturen of celinvasie assays ongeschikt thans voor ECM isoleren volgens deze methode. De werkwijze is vooral geschikt voor gebruik met standaard "2-dimensionale" celkweken. Omdat de ammoniumhydroxide extractie verwijdert de cellen volledig, ECM verbonden aan de bovenzijde van cellen en uitgescheiden, maar niet verknoopt zijn ECM eiwitten ook verwijderd, waarbij de schotel een dunne laag samengesteld ECM van beneden en rond de hellingen van de cellen 11,17
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods
De mogelijkheid om een breed scala aan experimenten met geïsoleerde ECM uit te voeren is het belangrijk in het kader van celbiologie en weefsel fysiologie, en het heeft ook gevolgen voor het gebied van weefselregeneratie en tissue engineering. De methode heeft voordelen ten opzichte van gels gevormd uit gezuiverd collageen of andere gezuiverde ECM eiwitten in dat de cellen assembleren complex ECM structuren op hun eigen formaat, met native verknoping mechanismen en met individuele ECM eiwitten die aanwezig zijn in verhoudingen aangepast aan de celtype van herkomst. Bijvoorbeeld, het proteomische studie van RCS ECM toonden overvloedige matrilins en COMP / TSP5, zoals verwacht vooreen kraakbeenachtige ECM 19,20 (figuur 4). In het algemeen wordt de analyse van cellen afgeleide ECM belemmerd door het karakter van een omvangrijke, proteïnenetwerk dat resulteert in covalente verknoping en de onoplosbaarheid van vele ECM-eiwitten, alsook door de potentiële verontreiniging van ECM extracten met intracellulaire eiwitten. Een multi-step procedure ontworpen om de ECM-fractie uit weefsels voor proteoomanalyse isoleren leverde 8% van de ECM eiwitten in de totale groep eiwitten geïdentificeerd 21. Echter, peptiden van ECM eiwitten waren 73% van de totale peptiden geïdentificeerd. Deze methode voor isolatie en analyse van cellen afgeleide ECM snel en betrouwbaar het celmateriaal behoud ECM eiwitten. Deze methode kan worden gebruikt voor diverse celtypes en verdere toepassingen en vergemakkelijkt de analyse van ECM biologie en cel-ECM interacties in celkweek. De protocollen detail hoe de werkwijze op verschillende schalen kan worden toegepast op een breed scala aan exp pakkenerimental vragen met betrekking tot ECM organisatie, dynamiek, of samenstelling, en de functionele effecten van geïsoleerde ECM op cellen.
Toekomstige toepassingen of richtingen na Mastering deze techniek
Kijkend naar de toekomst, kan de methode worden aangepast voor gebruik met 3D celculturen; dit zou de fysiologische relevantie te breiden. Cellen ontdane natief weefsel heeft groot potentieel als een matrix voor de regeneratie van verloren of beschadigde weefsel en als alternatief voor transplantatie, bijvoorbeeld na hartfalen 22. Het heeft de potentie om de problemen van donor beschikbaarheid en immunoafstoting overwinnen. Toekomstige toepassingen van de in dit verslag beschreven werkwijze kan het gebruik ervan met 3D celculturen of weefsel ontcelling, die verder de reikwijdte van deze benadering zou toenemen onderzoeken.
Acknowledgments
We zijn zeer dankbaar Dr. Belinda Willard, proteomics en metabolomics Laboratory, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, voor het uitvoeren van de proteomics analyse van RCS ECM. Wij erkennen de financiële steun van theMedical Research Council UK, verlenen aantal K018043, om JCA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
| Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 h. IF: 1/200 |
| Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 h |
| Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2,000 for 2 h |
| Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10,000 for 1.5 h |
| Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5,000 for 1.5 h |
| Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50 mg/mL in DMSO. 1/50 for 45 min |
| FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 h |
| FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 h |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50,000 for 1 h |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100,000 for 1 h |
| Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
| Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg/mL ascorbic acid |
| Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
| Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
| NH4OH, 28-30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2% (v/v) in PBS |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2% (v/v) final concentration |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5% (v/v) final concentration |
| GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
| Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
| Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
| PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
| Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
| WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
| High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
| SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
| Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot | |||
References
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903 (2012).
- Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).
- Hellewell, A. L., Adams, J. C. Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles. Bioessays. 38, 77-88 (2016).
- Li, D., Yang, W., Li, G. Y. Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).
- Strawich, E., Nimni, M. E. Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage. Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).
- Kim, B. S., et al. Human collagen isolated from adipose tissue. Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).
- Carter, W. G. Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140. J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).
- Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).
- Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region. J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hillenkamp, F., Karas, M. Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).
- Davis, M. T., et al. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix. Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).
- Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state. Biosci Rep. 35, (2015).
- Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture. J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).
- Myllyharju, J. Extracellular matrix and developing growth plate. Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).
- Roughley, P. J. Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage. Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).
- Naba, A., et al. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647 (2012).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
