Summary
Эта рукопись содержит протоколы , которые используют в внутриутробно электропорации (ИЭГ) , чтобы описать структурную связность нейронов на уровне одной клетки и возбудимости флуоресцентно меченных нейронов. Гистологии используется для характеристики дендритную и аксонов проекции. Запись цельноклеточная при острых срезов используется для исследования возбудимость.
Abstract
Нервная система состоит из огромного диапазона различных типов нейронов. Эти нейронные субпопуляции характеризуются, помимо всего прочего, их различных дендритных морфологией, их специфических форм аксонов соединений и их селективных реакций обжига. Молекулярные и клеточные механизмы, ответственные за эти аспекты дифференциации в процессе развития все еще плохо изучены.
Здесь мы опишем комбинированные протоколы для маркировки и характеризующие структурную связность и возбудимость корковых нейронов. Модификация протокола в маточно электропорации (ИЭГ) позволяет маркировать разреженной популяции нейронов. Это, в свою очередь, позволяет идентифицировать и отслеживать дендритов и аксонов отдельных нейронов, точной характеристики ламинарного расположения аксонов проекций и анализа морфометрического. ИЭГ также может быть использован для изучения изменений в возбудимостидикого типа (WT) или генетически модифицированные нейроны, комбинируя его с записью целых клеток от острых кусочков электропорации мозга. Эти два метода способствуют лучшему пониманию сочетания структурных и функциональных связей и молекулярных механизмов, контролирующих нейронную разнообразие в процессе развития. Эти процессы развития имеют важные последствия для аксонов проводки, функциональное разнообразие нейронов и биологии когнитивных расстройств.
Introduction
Развитие дендритных и аксонального структур является важным аспектом регулирования цепи в нервной системе, в том числе и в коре головного мозга. Он играет важную роль в процессе селективного проводки разнообразных нейронных субпопуляций. Ряд последних отчетов показали, что, в дополнение к связи, молекулярное разнообразие нейронов отражается приобретение весьма специфических режимов стрельбы. Однако механизмы , определяющие возбудимость и связность различных нейрональных подтипов в процессе развития, а также степень их координации, все еще плохо изучены 1, 2.
В естественных условиях убыт- и получить-оф-функции анализа позволяют для изучения взаимосвязи между уровнем экспрессии специфических генов и их влияние в развитии схемы. Внутриутробное электропорации (ИЭГ) представляет собой метод широко используется для изученияфункция представляющего интерес гена в конкретных нейронные популяции и изучить общие закономерности их соединения. Тем не менее, для определения морфологических характеристик аксонов и дендритов в кортикальных слоях в живых мышей, необходимо маркировать нейроны скудно. Рекомбинация система Cre в сочетании с ИЭГ может использоваться, чтобы отметить редкую популяцию нейронов при достаточно низкой плотности для разрешения проекции, излучаемые отдельными клетками определенных корковых пластинками. Этот метод метки достаточное количество нейронов в коре головного мозга , чтобы получить количественные данные после анализа разумных числа электропорации мозга (рисунок 1). Эта рукопись представляет собой метод для такого тонкого анализа связности. Она также представляет собой ту же стратегию, чтобы проанализировать, в отдельных экспериментах, электрические свойства нейронов путем выполнения текущего хомута записи на зеленый флуоресцирующий белок (GFP) -electroporated клетки от острых корковых срезов. Эти протоколы являются универсальными и могут быть применены к изучению возбудимости и связи нейронов WT и трансгенных животных, а также нейронов, в которых потери и выигрыши функции вводятся дополнительные плазмид во время ИЭГ.
Хотя этот протокол описывает электропорации мышей на эмбриональный день (E) 15,5, эта методика может быть выполнена в любом возрасте между E9.5 3 и постнатальный день (P) 2 4. Хотя электропорации на ранних стадиях цели нейроны и предшественники таламуса и глубокие слои коры, поздних стадиях электропорации метки более поверхностных слоев (например, нейроны E15.5 ИЭГ мишени слой II-III). Таким образом, сочетание ИЭГ с морфологическим анализом и электрофизиологии одноклеточного является полезным инструментом, чтобы выяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе огромного структурного и функционального разнообразия нейронов в нервной системе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных были одобрены Мадридской уходу и использованию животных комитета, в соответствии с национальным и европейским законодательством (ProEX 118/14; ProEX 331/15). Поддержание стерильных условий во время процедуры.
1. В Utero Электропорация
Примечание: Этот протокол для ИЭГ адаптирован из других , которые были ранее опубликованной 5, 6, 7. Эта рукопись описывает протокол для ИЭГ из E15.5 эмбрионов, с изменениями в стратегии репортер , которые позволяют для изучения морфологии отдельных нейронов 8 и их электрофизиологических свойств в отдельном эксперименте с использованием стандартных GFP репортер плазмид.
- Подготовка ДНК
- Подготовка плазмид ДНК с использованием набора для выделения эндотоксина свободной в соответствии с инструкциями изготовителя и развести их в 1x рhosphate-солевого буферного раствора (PBS).
- Для маркировки одноклеточного, готовят 10 мкл смеси ДНК на операции (1 мкл на эмбрион) , используя следующие конструкции и конечные концентрации: плазмиду , кодирующую флуоресцентный белок репортера (например, CAG-DsRed2 9), 1 мкг / мкл в качестве контроля для повышения эффективности электропорации; Экспериментальная плазмида, подлежащих испытанию, как правило, в количестве от 1 мкг / мкл; LoxP-стоп-LoxP-флуоресцентный белок плазмиду (CALNL-GFP 10), 1 мкг / мкл; и построить кодирующий Cre 10, 1 - 4 нг / мкл. Добавить 1 мкл 0,1% Fast Green в воде (вес / объем), чтобы визуализировать впрыскивается ДНК.
Примечание: Cre рекомбинация GFP конструкции происходит только в нескольких нейронов, что позволяет визуализировать и реконструкцию отдельных аксонов проекций (Рис . 1А) - Для стандартных исследований патч-зажим, готовят 10 мкл смеси ДНК в операции (1 мкл на EMBRлет) из следующих плазмиды , кодирующей флуоресцентный белок (например, CAG-GFP 11), 1 мкг / мкл в качестве контроля репортера; Экспериментальная плазмида, как правило, 1 мкг / мкл; и 1 мкл 0,1% Fast Green в воде (вес / объем).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это стандартные условия электропорации, анализирующие острые срезы, содержащие большое количество меченых возбуждающих нейронов в пределах желаемого листовой пластинки. Для проведения исследования патч-зажим в одиночных камерах, подготовьте ДНК, как описано в шаге 1.1.1.1.
- Для маркировки одноклеточного, готовят 10 мкл смеси ДНК на операции (1 мкл на эмбрион) , используя следующие конструкции и конечные концентрации: плазмиду , кодирующую флуоресцентный белок репортера (например, CAG-DsRed2 9), 1 мкг / мкл в качестве контроля для повышения эффективности электропорации; Экспериментальная плазмида, подлежащих испытанию, как правило, в количестве от 1 мкг / мкл; LoxP-стоп-LoxP-флуоресцентный белок плазмиду (CALNL-GFP 10), 1 мкг / мкл; и построить кодирующий Cre 10, 1 - 4 нг / мкл. Добавить 1 мкл 0,1% Fast Green в воде (вес / объем), чтобы визуализировать впрыскивается ДНК.
- Подготовка плазмид ДНК с использованием набора для выделения эндотоксина свободной в соответствии с инструкциями изготовителя и развести их в 1x рhosphate-солевого буферного раствора (PBS).
2. Подготовка к хирургии
- Выполните операцию выживания с использованием асептических методов. Обеспечение стерильных условий, в том числе маски, перчатки, инструментов и операционного поля. Стерилизовать хирургические инструменты (скальпель, Адсон щипцов, закаленные тонких ножниц, изогнутые ножницы, Дюмон щипцов, и держатель иглы).
- Выберите боросиликатного стекла капилляры 1 / 0,58-мм наружный / внутренний диаметр. Прицепные колпачокillaries 3. Целевой показатель для оптимальной длины наконечника 1 см после вытягивания. Обрежьте кончик иглы приблизительно под углом 30 ° с использованием тонких щипцов (рис 1В).
- Приготовьте 500 мл стерильного изотонического раствора (1X PBS или Hank's сбалансированный солевой раствор (HBSS)). Добавить пенициллин-стрептомицина 1: 100 и нагреть этот раствор до 37 ° С. Его можно хранить при температуре 4 ° С после операции.
- Подкожно вводят предоперационной дозу анальгетиков (например, карпрофен, 5 мг / кг веса тела).
- Держите животных теплой для хирургии, помещая их на грелку. Подогрейте чистую клетку до 37 ° C для послеоперационного восстановления.
3. хирургия
- Обезболить в C57BL / 6 E15.5 беременной мыши с изофлуран. Во-первых, влить закрытую камеру с 3% изофлуран в 0,8 л / мин кислорода и оставить мышь внутри, пока он не спит. Передача мыши на грелку и поместите нос и рот внутри маски для доставкиу изофлурана. Постепенно уменьшить анестезию в течение операции до 1,5% изофлуран через маску. Подтвердите надлежащее обезболивание, наблюдая потерю рефлекса педали (схождение пинч). Оптимальная процедура занимает приблизительно 20 мин и не более 45 мин.
- Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить глаз от высыхания во время процедуры.
- Удалить волосы с ~ 3 см области живота (с использованием либо электробритву или депиляции кремом). Промыть хирургическую область с ватным тампоном инфузию 70% этанолом, а затем йодом проникнуты ватным тампоном. Повторите три раза.
- Накройте хирургическая область стерильной марлей для профилактики инфекций.
- Используйте скальпель, чтобы сделать вертикальное отверстие через кожу длиной 2 см и параллельно средней линии. Отделить кожу и мышцы живота с помощью тупых ножниц изогнутые. Держите мышцы с пинцетом и разрезать его через белой линии, чтобы обнажить брюшную полость.
- Найдите эмбрионов с помощью Oе пинцетом. Смочить два мокрых ватных тампонов с стерильным физиологическим раствором, приготовленным на стадии 2.3, и использовать их, чтобы манипулировать доступный эмбрион из отверстия. Поместите ватные тампоны вокруг эмбриона и осторожно извлечь оба рога матки из брюшной полости. Держите эмбрионов и открытую брюшную полость гидратированных с теплым физиологическим раствором в течение всей процедуры, чтобы предотвратить их от высыхания.
4. Введение ДНК и электропорацию
- Манипулирование эмбрионов осторожно пальцами, чтобы определить местонахождение телэнцефалона (может быть четко визуализируется глазом как более двух передних везикул головного мозга). Поместите подготовленную боросиликатного капилляр в рот пипеткой. Пропускают кончик иглы через матку, избегая кровеносных сосудов, до тех пор, пока не достигнет одной боковой желудочек. Медленно вводят приблизительно 1 мкл раствора быстрого зеленого цвета ДНК до тех пор, пока наблюдается большое синее пятно.
- Поместите 7-мм платиновые электроды в боковом направлении по наце головы зародыша (рис 1C).
Примечание: ДНК отрицательно заряженные; следовательно, она движется к положительному электроду, когда напряжение прикладывается между платиновыми электродами. Изменяя расположение электродов, различные участки мозга могут быть направлены. - Подайте напряжение с помощью платиновых электродов (для E15.5 эмбрионов:. 5 импульсов, 38 В, 50 мс интервал длительность цикла составляет 950 мс интервал паузы Эти условия варьируются в зависимости от стадии развития) 12.
Примечание: см Таблицу 1 для условий напряжения и электродов для различных стадий эмбриона. - Повторите шаги 4.1 - 4.3 для каждого эмбриона.
5. Конец хирургии и послеоперационного
- Используйте ватные тампоны, чтобы манипулировать обратно в матку матери. Наполните брюшной полости с подогретым физиологическим раствором (добавляют приблизительно 2 мл).
- Шовный мышцы с простыми узловыми швами или непрерывным швом. Использование # 6-0 шовныйs.
- С помощью скобы, чтобы закрыть внешнюю рану. Будьте осторожны, чтобы отделить кожу от мышц до сшивание. Снимите маску носа.
- Разрешить мыши для восстановления в течение 30 мин в нагретую, чистой клетке перед установкой его в комнате вивария. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не оставляйте животное, которое прооперированы в компании других животных, пока полностью не выздоровел.
- Контролировать животное в течение дней после операции. Применяют анальгетики подкожно (карпрофен, 5 мг / кг массы тела) каждые 12 ч в течение 2 дней или в соответствии с законодательством животного. Никаких дополнительных послеоперационный уход не требуется для щенков.
6. Подготовка и анализ образцов
- Дополнительно: На Р2, проверьте выражение флуоресценции в электропорации мышат с использованием флуоресцентного микроскопа; когда ИЭГ успешно, флуоресценция ясно видно Iп головку 13. Марк или отделить мышей, которые положительно электропорации для использования в следующих шагах. Держите плотины и щенков в стандартных условиях вивария.
- На желаемой стадии исследования, заливать мышей транскардиальную. Как правило, наиболее активная фаза дендритов и аксонов роста соответствует первым трем послеродовых недель 2, 14, 15.
- Приготовьте 30 мл 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS на мышь и охладить его на льду.
ВНИМАНИЕ: PFA является известным аллергеном и канцерогеном. Он токсичен. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
Примечание: Количество PFA требуется зависит от возраста мыши (например, для Р16, 20 мл для перфузией и 10 мл для вторичная фиксация необходимы). - Подготовить кетамин-ксилазином смесь обезболить животное с соотношением 1: 8 объемного 100 мкг / мл кетамина:: 1 100 мкг / мл хylazine: PBS (около 0,2 готовят мл на мышь).
- Обезболить мышь путем внутрибрюшинной инъекцией 0,2 мл смеси, полученного на стадии 6.2.2.
- Поместите наркозом мыши на его спине. Сделать горизонтальный надрез над грудной клеткой с помощью скальпеля. Разрежьте мышцу и диафрагму с тонкими ножницами, пока сердце не наблюдается.
- Сделайте надрез в правое предсердие с изобразительным ножницами. Медленно вводят 20 мл PBS в левом желудочке с 25-го калибра иглы, чтобы удалить кровь. Вводят 20 мл PFA (этап 6.2.1), пока мышь не является жесткой и органы становятся белыми.
- Немедленно снять головку и сделать срединный разрез в коже от шеи к черепу. Аккуратно отслаиваться череп с помощью изогнутых щипцов и извлечь мозг. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не проколоть или повреждение мозга во время удаления черепа. Помещенный мозг в 10 мл 4% PFA при 4 ° С в течение ночи, чтобы суффиксом его.
- Приготовьте 30 мл 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS на мышь и охладить его на льду.
- Cryoprotecт фиксированный мозги в 10 мл 30% -ной сахарозы в PBS при 4 ° С в течение 1 - 2 дней, пока они не тонуть. Подготовьте 1 см 3 кубов из алюминиевой фольги. Заполните кубов 2/3 пути с ОКТ. Положите мозги внутри и заморозить их, помещая кубики на сухом льду. Хранить замороженные мозги при -80 ° С.
- Место капли ОКТ на поверхности образца диска, кожура алюминиевой фольги от гистологии куба, и поместите куб в нужной ориентации образца диска на верхней части жидкости OCT. Применить твердое давление до тех пор, пока не будет устранена. Вставьте диск образца в образец головы криостата. Сориентируйте образец (переместить его в выгодном положении относительно ножа / лезвия).
- Раздел мозги на криостата. Выберите 50 - 100 мкм толщиной плавучие криосрезы 16 с помощью тонкой кисти и поместите их в PBS.
- Пятно при желании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения морфологии аксонов, окрашивание с GFP антителом настоятельно рекомендуется- Блок секций в течение 1 ч при комнатной температуре с 5% фетальной бычьей сыворотки в PBS, содержащем 0,5% (блокирующий раствор) Тритон-Х 100. Инкубируют в течение ночи при 4 ° С с 1: 500 первичных антител (например, кролик анти-GFP) , разводили в блокирующем растворе.
- Вымойте секций три раза в PBS. Добавить 1: 500 вторичных антител (например, козы против кроличьего Alexa Fluor 488) разводили в блокирующем растворе и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Вымойте секций три раза в PBS.
- Проводят контрастное с DAPI (1: 10000) в PBS, содержащем 0,5% Тритон-Х-100 в течение 10 мин. Промыть участки с PBS. Установите секции в водной среде монтажной 16.
7. Анализ и обработки изображений
- Флуоресценция или конфокальной микроскопии
- Для того, чтобы восстановить полные нейроны, приобретают изображения с большим увеличением (по крайней мере 40х) и высоким разрешением (минимум 1024 х 1024). Выберите "Tile сканирование "или эквивалентный вариант в программе приобретения, чтобы покрыть область интереса, охватывая все дендритов и аксонов процессов. Приобретайте достаточное количество стопок на оси, чтобы избежать потери информации.
Примечание: Как правило, программное обеспечение микроскопа имеет опцию "Оптимизированный стек", но если это не так, то тест вручную, чтобы определить, сколько шагов необходимы для изображения перекрываются, чтобы правильно определить отдельные выступы. Два ключевых параметров являются обскура и цель; принимать во внимание "большем увеличении, большее разрешение и более необходимых Z-шагов."
- Для того, чтобы восстановить полные нейроны, приобретают изображения с большим увеличением (по крайней мере 40х) и высоким разрешением (минимум 1024 х 1024). Выберите "Tile сканирование "или эквивалентный вариант в программе приобретения, чтобы покрыть область интереса, охватывая все дендритов и аксонов процессов. Приобретайте достаточное количество стопок на оси, чтобы избежать потери информации.
- Анализ
Примечание: Хотя некоторые параметры могут быть проанализированы, шаг 7.2.1 фокусируется на двух: дендритов и аксонов морфологии ветвления. Скачать Фиджи ( http://fiji.sc/ ).- Откройте изображение, выберите "сегментированные строки" вариант из меню. Нарисуйте линию (перемещение вверх и вниз вдоль йе Z-оси с помощью прокрутки мыши) в соответствии со структурой нейроне. Перейдите к разделу "Анализ, инструменты, ROI менеджер, Add" (В качестве альтернативы, нажмите "T"), чтобы сохранить линию. Повторите этот процесс для каждого аксона или дендрита анализируемого нейрон 2.
- В меню нажмите ROI Manager, кнопка "Мера", чтобы получить длину (или дополнительные параметры). Экспорт измерений в текстовый файл или электронную таблицу, чтобы проанализировать их.
8. электрофизиологии
Примечание: Целью данного протокола является получение целых клеток записи ток-зажим от слоя II / III пирамидальные нейроны клеток, определенные визуально по экспрессии GFP в GFP-электропорации мозга мыши (или любой другой флуоресцентный белок ранее электропорации). Это адаптация ранее опубликованных методов 17, 18. При использовании этого протокола можно изучить влияние генетической MODIFication введенный ИЭГ на электрические свойства нейрона. Приобретение конкретных режимов обжига происходит постепенный процесс дифференциации, который включает в себя динамическое выражение широкого репертуара ионных каналов и что приводит к экспрессии переходных режимов стрельбы до того поздних этапах постнатального развития. Например, зрелые электрические ответы не наблюдаются в слое II / III коры соматосенсорной мыши перед P16 2, 19.
- Предпосылки для острых срезов
- Подготовьте стерильные инструменты операцию по удалению мозга у мышей: гильотины, чтобы вынуть голову; маленькие ножницы, чтобы вырезать через череп; пинцет, чтобы отделить череп от ткани; шпатель, деликатно удалить мозговую ткань из корпуса; металлический ломтерезки, рассечь кору головного мозга на две равные части; и пипетки Пастера, чтобы переместить кусочки из vibratome (поместите их в раствор, содержащий искусственную спинномозговую жидкость (ACSF) для проверки, а затем передать ломтики из ACSF в зону выдержки инкубационный).
- Готовят 1 л ACSF с использованием воды высокой чистоты (бидистиллированной воды) , содержащего 119 мМ NaCl, 26 мМ NaHCO 3, 11 мМ глюкозы, 2,5 мМ KCl, 1,2 мМ MgCl 2, 2,5 мМ CaCl 2 и 1 мМ NaH 2 PO 4. Титруйте рН до 7,3 - 7,4 с помощью HCl или NaOH. Отрегулируйте осмолярности до 290 мОсм.
- Пузырь ACSF с карбогена (95% O 2/5% CO 2) в течение 15 - 20 мин с использованием тефлоновые трубки (~ 1 мм), для стабилизации рН до 7,3 - 7,4.
- Замораживание 200 мл насыщенного раствора ACSF с карбогена при -80 ° С в течение 10 - 15 мин, чтобы генерировать слякотном раствор рассечение. Поместите 100- х 20 мм блюдо культуры ткани на льду для нарезки мозга.
- Приготовьте 100 мл 1% раствора агарозовом легкоплавкого непосредственно перед началом эксперимента. Охлаждают раствор, вырезать квадратный кусок агарозы (размеры: 1 х 1 х 0,5 мм), и суперклей его кЗадняя часть платформы, прямо позади, где разрезается мозг (агарозный гель обеспечивает поддержку для мозга во время нарезка). Сделайте фронт как можно более плоскими.
- Получение острых срезов
- Зафиксировать мыши и обезболить его с изофлурановым 2%. Поместите голову в отверстие гильотины и обезглавить его быстро. Удалите его череп как можно быстрее с использованием костных рейнджеров или тонким пинцетом. Поместите мозг в охлажденный ACSF.
Примечание: Важно выполнить этот шаг быстро. - Поместите мозг в охлажденной культуральной чашке. Отрежьте мозжечка с маленькими ножницами.
- Возьмите мозг с помощью шпателя и промокните его насухо на бумажное полотенце.
- Клей ventrocaudal плоскость мозга на держателе vibratome. Поместите держатель на vibratome, наполненную ледяной ACSF.
- Получить острые срезы путем разрезания 300-мкм корональных секций (обеспечить длительный срок carbogenation в течение всей процедуры, например, поместить барботер (1 ммполитетрафторэтилен трубка) в vibratome камере) с использованием следующих параметров vibratome: амплитуда 0,06-мм и 0,08 - 0,10 мм / с Скорость. Установите продвижение к медленному возможной скорости (~ 22 сек за проход). Измените эти оптимальные параметры и получить оптимальные условия для каждой машины эмпирически, если это необходимо.
- Выдержите острые ломтики в течение по крайней мере 60 минут в ACSF с добавлением 3 мМ мио -inositol, 0,4 мМ аскорбиновой кислоты и 2 мМ пирувата натрия при продувании с 95% O 2/5% CO 2 газа. Поддерживают температуру при 25 ° С.
- Выполните процедуру нарезки менее чем за 15 мин. При желании, кусочки можно хранить в течение 1 - 7 ч перед переносом в камеру записи для использования.
- Зафиксировать мыши и обезболить его с изофлурановым 2%. Поместите голову в отверстие гильотины и обезглавить его быстро. Удалите его череп как можно быстрее с использованием костных рейнджеров или тонким пинцетом. Поместите мозг в охлажденный ACSF.
- Предпосылки для записи целых клеток
- Убедитесь, что электрофизиологии станция оснащена камерой записи, система перфузии, микроскоп, электроды (записи, стимулирующий, и земля), макро- и MICRomanipulators, жесткая вибростойкий столешница и клетка Фарадея, стимулятором, усилитель и аналого-цифровой (A / D) конвертер, компьютер с программным обеспечением сбора данных, и GFP (или любой другой флуорохромом) фильтр для анализа генетически модифицированные нейроны 18 (фиг.2А).
- Готовят внутриклеточный раствор, содержащий 115 мМ глюконат калия, 2 мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES, 20 мМ KCl, 4 мМ Na 2 АТФ и 0,3 мМ Na 3 ГТФ, доведенный до рН 7,2 с помощью KOH и 290 мОсм по KCl.
- Сделайте патч пипетки, потянув боросиликатного стекла капилляров. Подготовьте патч электродов с использованием микропипетки съемник. Использование боросиликатного капилляров (1,5-мм внешний диаметр, 0,86-мм внутренний диаметр, длина 10 см). Сделайте патч электроды показывая сопротивление 3-10 МОм при заполнении внутриклеточного раствора.
- Заливать записи камеры с ACSF со скоростью 2 мл / мин. Поддерживать температуру камеры на approximленно 33 ° С.
- Запись цельноклеточная
- Перенесите ломтики в камеру записи с помощью пипетки Пастера (отрезать длинный кончик) или маленькую кисть. Удерживая кусочек с арфой. Заливать ломтики постоянно с ACSF со скоростью 2 мл / мин.
- Пластыря GFP-положительных нейрон.
- Положите ломтик в записи камеры и найти интересующую область с помощью микроскопа при малом увеличении (10х). Затем найти GFP-позитивных клеток для исправления с помощью 60x цели.
- Заполните записи электрода с внутриклеточным раствором. Используйте шприц, связанный с фильтром (4-мм фильтр) и микро-погрузчик наконечник для заполнения электрода записи с внутриклеточным раствором.
- Поместите стеклянную пипетку в держатель пипетки. Поместите кончик пипетки в ванну и сосредоточиться на кончике. После того, как пипетка находится в ванне, применять положительное давление через систему управления давлением обратно.
- Патч нейрон , который люминесцентная (рисЮр 2B).
- Подход клеток, представляющих интерес под визуальным руководством, сохраняя при этом обратное давление в пипетку. После появления небольшой лунки на поверхности клетки, ослабить давление. В этот момент может быть сформирована герметичное уплотнение (сопротивление больше, чем 1 ГОм). В противном случае, нанесите легкий отрицательное давление (всасывание), чтобы облегчить его.
- В то время как печать формируется, довести зажим проведение напряжения до -60 мВ. После того, как ГОм уплотнение образуется, применить импульс всасывания к разрыву клеточной мембраны под пипеткой и перейти в режим целых клеток. См ссылку 20 для получения более подробной информации.
- Запись активности с использованием условий текущего зажима 21. После того, как в режиме цельноклеточная, перейти от напряжения-хомутом в режим текущего зажима и начать запись. Например, чтобы записать клеточную возбудимость, применять 500 мс-долго деполяризующими текущие инъекции (100 - 400 Па).
- Рассчитывают теплотехнической бу черчения число потенциалов действия вдоль поезда для увеличения входных токов.
Примечание: Resting мембранный потенциал, входное сопротивление, и мембранную емкость также может быть вычислена из записей 21.
- Рассчитывают теплотехнической бу черчения число потенциалов действия вдоль поезда для увеличения входных токов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы охарактеризовать морфологические изменения нейронов в деталях и на протяжении развития, важно обозначить нейроны редко. Cre-рекомбиназу разбавленный система допускает экспрессию представляющего интерес гена в разреженной популяции нейронов, так что только те нейроны , которые включают этот фермент выразить GFP (Фигура 1А). Используя эту стратегию, слой II-III предназначен и помечены ИЭГ на E15.5. CAG-DsRed2 на 1 мкг / мкл, совместно электропорации в качестве контроля и выявления положительных электропорации мозги у живых животных. Важно отметить, что после окрашивания анти-GFP антитела, сигнал достаточно силен , чтобы позволить четкой визуализации их дендритных морфологией и аксонов (рис 1D и Е).
После того, как ИЭГ и электрофизиологических, анализ параметров, полученных из записей целых клеток используются для совместногоmpare ответов огневые и возбудимость электропорации клеток в различных условиях. Некоторые параметры могут быть получены. Параметры должны быть адаптированы к конкретному исследованию с использованием специального программного обеспечения для анализа патч-зажим. Рисунок 2C представлен пример сюжета потенциалов действия против входного тока , полученных из записей в WT слоя II-III нейрон , который был электропорации на E15.5.
Рисунок 1. Cre-рекомбиназу Разводненная стратегия позволяет Sparse маркировки корковых нейронов. А. Схематическое краткое изложение стратегии. В нейронах, несущей как CALNL-GFP и CRE, кассета LoxP-СТОП-LoxP вырезают из CALNL-GFP и GFP выражается сильным CAG промотором. B. Схематическое изображение боросиликатного капилляра вытащил с помощью микропипетки съемник. Наконечник обрезается фоrceps, создавая угол 30 °. Мера 1 см от кончика до начала узкой части капилляра. C. Положение электродов для целевой соматосенсорной коры головного мозга. Платиновые электроды расположены примерно на уши эмбриона. Из-за отрицательного заряда, ДНК переходит к положительному электроду при приложении напряжения. Изменение положения электродов позволяет ориентированных на различные области мозга. D. Изображения , полученные после того, как векторы были доставлены в слой нейронов II-III путем внутриутробно электропорации в эмбриональной день 15,5; Коронарные срезы были сделаны в постнатальный день 16. Вектор CAG-DsRed2 котрансфицировали в качестве контроля (слева). GFP (средний) выражается только в тех нейронов, которые также включены Cre, что позволяет рекомбинации LoxP сайтов в векторе CALNL-GFP. Редкая маркировка позволяет отдельные нейроны следует отличать (наконечники стрел). E. Высокая увеличение конфокальной изображение тон дендритных беседок другого скудно меченого GFP нейроне. Масштабные полоски = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Настройки электрофизиологии и пример огневого Response. А. Фотография показана установка электрофизиологии , используемый для зажима патч экспериментов в острых срезов. Установка входит в клетку Фарадея, чтобы устранить шум, и оборудование находится на верхней части таблицы антивибрационные. Контроллеры моторизованных микроманипуляторами для электродов наблюдаются на левой стороне. B. пирамидальный нейрон мыши электропорации с GFP, наблюдается при ярком поле и зеленых условиях флуоресценции. Пипетка запись, прикрепленную к GFP + клеток заметно. Шкала бар = 10 & #181; м. С. розжига модели в CAG-GFP электропорации управления слоями II-III нейрон , показывающий типичный регулярный-пики ответ. Распределение потенциалов действия приближается к регулярным распределением по продолжительности входного тока (ось х). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| стадия | напряжение | Электроды | Рекомендации |
| E9.5 | 7 В, 100 мс, 3 импульса | Палка платиновые электроды | Matsui и др. , 2011 3 |
| E12.5 | 30 В, 50 мс, 3 - 5 импульсов | Электроды Щипцы типа 3 мм | Саито, Т., 2006 12 | </ TR>
| E15.5 | 35-48 В, 50 мс, 5 импульсов | Электроды Щипцы типа 5-7 мм | Родригес-Tornos и др. 2016 года 2, Сайто, Т., 2006 12 |
| P2 | 100 В, 50 мс, 5 импульсов | Электроды Щипцы типа 5-7 мм | Sonego и др. 2013 4 |
Таблица 1: Условия и напряжения Электроды для электропорации эмбрионы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол подробно описывает, как маркировать нейроны соматосенсорной коры у мышей C75BL / 6, с тем, чтобы проанализировать их связь и их возбудимость. Что касается существующих методов, она визуализирует дискриминационные аспекты связи, такие как количество аксонов ветвей на нейрон, их точной топографии и их анатомического расположения. Намерение изменить положение электродов, можно предназначаться другие популяции нейронов, таких как поясной извилины (сохранить тот же угол между электродами и головного мозга, но изменить ориентацию полюсов) или гиппокамп 5, и выполняют аналогичные эксперименты маркировочная отдельные нейроны или более широкие группы населения, в зависимости от желаемой стратегии. Тем не менее, существуют ограничения на это, так как не все население одинаково доступны или одинаково селективно помечены. Например, в гиппокампе, можно выборочно предназначаться позднего происхождения нейроны области СА1, но Э.А.Rly электропорации отмечает гетерогенные популяции внутренних и внешних клеток пирамидальных. В коре головного мозга, нейроны рождаются в последовательном порядке, поэтому гестационный день во время ИЭГ определяет, какой корковый слой влияет. Выполнение более ранних ИЭГ целевых показателей более глубокие нейроны (например, ИЭГ на Е14 этикетки слой IV нейроны) 22.
Для успешного ИЭГ, рекомендуется принимать во внимание некоторые соображения. Во-первых, важно, чтобы сделать операцию менее чем за 30 минут, чтобы уменьшить нагрузку на матери и повысить шансы на выживание детенышей. Во-вторых, самая трудная часть процедуры является введение ДНК-выполняют инъекцию через боросиликатного капилляров как можно более осторожно. Если эмбрионы прижаты слишком сильно, они могут быть причинен вред. С точки зрения устранения неисправностей смерть эмбрионов во время инъекции ДНК, скашивать наконечник с углом 30 ° может повысить эффективность этого процесс. Если Кромкорез не доступен и капилляры вырезаются исключительно с пинцетом, правильный угол может быть подтвержден в рассекает микроскопом. Откажитесь неадекватные капилляры. И, наконец, адаптируя условия электропорации на стадии эмбриона имеет важное значение для того , чтобы увеличить коэффициент выживаемости (таблица 1).
Некоторые соображения необходимы в связи с реконструкцией аксонов и дендритов. Маркировать отдельные нейроны, надлежащая концентрация плазмиды Cre имеют важное значение для получения хорошего, разреженный выражение и, чтобы избежать сбивающий перекрытие нейрональных проекций, относящихся к различным нейронов. Хотя этот протокол предлагается использовать 4 нг / мкл, может быть необходимо регулировать концентрацию плазмиды для каждого эксперимента, в зависимости от промотора , используемого, качество препарата ДНК, и метод количественного определения ДНК (например, уменьшить его 2 нг / мкл, если маркировка слишком много нейронов). В дополнительна, для отслеживания аксонов, важно, чтобы отрезать под соответствующим углом, с тем, чтобы иметь весь нейрон в той же плоскости.
Критические шаги для успешной записи патч-зажим являются здоровье ткани острых срезов и расположение и обилие электропорации GFP-позитивных нейронов. Если латание действия не увенчались успехом или отклоняющиеся ответы найдены во время записи, сократить время для обработки острых срезов. Если GFP нейроны трудно идентифицировать и определить местонахождение из-за их уменьшенных количествах в острой срез, обеспечить наличие достаточного количества плазмидной CAG-GFP, включен в электропорации смесь. Что касается основных ограничений подходов, описанных в настоящем документе, метод пэтч-кламп позволяет записывать множество различных параметров, характеризующих возбудимость нейрона, но она не оценивает аспекты, которые зависят от всей цепи. Кроме того, и как указано выше, не все нейронные субпопуляции доступны через ИЭГ. Таким образом, в те будущее, эти методы могут способствовать дальнейшему анализу структурно-функциональной связности различных нейронных субпопуляций в головном мозге.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны Р. Гутьеррес и А. Моралес за отличную техническую помощь и LA Weiss для редактирования. БГКП финансируется испанский Ministerio де Ciencia е Innovación (MICINN), ИПИ-BES-2012-056011. Эта работа финансировалась за счет гранта от Фонда BBVA и SAF2014-58598-Жин (MINECO) к М. Наваррете и гранта от Фонда Рамона Areces и грантов SAF2014-52119-R и BFU2014-55738-REDT (от MINECO) до М. Ньето.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP | |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP | |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP | |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP | |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 | |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Scalpel Handle # 3 - 12 cm | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades # 10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Adson Forceps-Serrated - Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Hardened Fine Scissors - Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14.5 cm | Teleflex | PO143281 | |
| Thin curved tips - Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Mathieu Needle Holder - Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 | |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL | |
| 9 mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 | |
| Sutures - Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 | |
| Borosilicate glass capillaries (100 mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 | |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | - | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 | |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 | |
| OCT Compound | Sakura | 4583 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 | |
| Microscope for Fluorescent Imaging - MZ10F | Leica | - | |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | - | |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | - | |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | - | |
| Cryostat - CM 1950 | Leica | - | |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | - | |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A | |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 | |
| Air Table | Newport | - | |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | - |
References
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
