Optimeret Analyse af<em> In vivo</em> og<em> In vitro</em> Nedsat Steatose
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
Fedme er et voksende sundhedsproblem i de udviklede lande og udviklingslande. Det er blevet rapporteret at være en af de samtidige tilstande ofte forbundet med alkoholiske fedtlever sygdom (NAFLD), med en prævalens på mellem 30 og 100 procent i NAFLD patient 1. På grund af den tætte sammenhæng mellem fedtlever og fedme, er diæt-induceret fede (DIO) musemodeller almindeligt anvendt til at undersøge de komplekse molekylære mekanismer, der er forbundet med udviklingen af NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Leversteatose er den tidligste fase af NAFLD, og det kan udvikle sig til ikke-alkoholiske steatohepatitis (NASH), skrumpelever, og i sidste ende, leverkræft 7. Derfor det overordnede mål med denne metode er at generere dyre- og celle modeller af hepatiske steatotic betingelser og PRovide detaljerede protokoller for effektiv og præcis lipid måling. Disse modeller og målinger er også nyttige til undersøgelse af andre metaboliske lidelser, såsom insulinresistens og type 2-diabetes.
Som fedme er identificeret til at være en af de vigtigste risikofaktorer for NAFLD, en højt fedtindhold, er høj-sucrose kost (HFHS), der efterligner vestlig fedtrig kost anvendes til at fremkalde fedme hos mus. Efterfølgende kan vurderes graden af hepatisk steatose hjælp af forskellige metoder. Første, kropsvægt og kropssammensætning analyse med kernemagnetisk resonans (NMR) viser lipidakkumulering under fodring tid. Fedtmassen og lean masse kan kvantificeres på en ikke-invasiv og tidstro måde.
Desuden er magnetisk resonans (MRI) anvendes til at vise både hele kroppen og leveren fordeling af fedt. Den gråtoner signal af MRI-analyse kan omdannes til en læselig pseudo-farve, og intensiteten afgråtoner og farve er hemi-kvantificerbare. Denne teknologi giver enestående fordele ved måling af lipid akkumulering i levende dyr. For det andet, histologisk analyse af leveren er den mest anvendte metode til bestemmelse leversteatose. Hematoxylin og eosin (H & E) -farvning giver histologisk information, såsom hepatocyt morfologi og makrofaginfiltration, mens Oil Red O-farvning viser størrelsen og placeringen af lipiddråber i hepatocytter. Tredje, lipidindholdet analyse under anvendelse af chloroform / methanol-ekstraktion er en nøjagtig og kvantitativ måling af hepatiske lipider. Total triglycerid og kolesterol kan måles med biokemiske metoder. Vigtigt er det, kan lipidekstraktion analyse og Oil Red O-farvning også anvendes i genetisk manipuleret eller farmaceutisk behandlet hepatocytter.
Fordelen ved den foreliggende fremgangsmåde er dens udnyttelse af flere optimerede fremgangsmåder til at generere hepatiske steatotic modellerog at omfattende karakterisere de fænotyper både in vivo og in vitro. DIO musemodeller kan rekapitulere patologien og metaboliske fænotyper af human fedtlever sygdom. Andre metaboliske parametre hos mennesker kan replikeres i denne model samt 8. Frembringelsen af den steatotic hepatocyt model som reaktion på højt glucoseindhold plus insulin er effektiv, nyttig og overvinder begrænsningen af dyre og tidskrævende muse arbejde. Alle disse metoder er tilstrækkelige og afgørende for studiet af hepatisk lipid dysfunktion og insulinresistens under næringsstof overbelastning.
Protocol
Representative Results
Discussion
NAFLD er en serie af progressive leversygdomme, der er forbundet med metaboliske syndrom, fedme, insulinresistens, eller type 2-diabetes mellitus (T2DM) 11. Kendetegnende for NAFLD er steatosis, ophobning af lipid i hepatocytter. Her er et spektrum af metoder præsenteret for karakterisere fænotyper og parametre for leversteatose hjælp DIO mus og mus primære hepatocytter. Denne procedure kunne være nyttigt at belyse de molekylære mekanismer i NAFLD og andre relaterede stofskiftesygdomme. </p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
Riferimenti
- Angulo, P. Medical progress – Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
