Qui, vengono descritti metodi ottimizzati per generare modelli in vivo e in vitro di steatosi epatica e per analizzare i fenotipi steatotici e i relativi parametri fisiologici.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Stabilire un sistema di procedure per caratterizzare qualitativamente e quantitativamente la steatosi epatica in vivo e in vitro è importante per lo studio metabolico nel fegato. Qui vengono descritti numerosi saggi per misurare in modo completo il fenotipo e i parametri della steatosi epatica in modelli murini ed epatociti.
Combinando i metodi fisiologici, istologici e biochimici, questo sistema può essere utilizzato per valutare il progresso della steatosi epatica. In vivo, le misurazioni del peso corporeo e della risonanza magnetica nucleare (NMR) forniscono una comprensione generale dei topi in modo non invasivo. L'ematossilina e l'eosina (H&E) e la colorazione con olio rosso O determinano la morfologia istologica e la deposizione lipidica del tessuto epatico in condizioni di sovraccarico di nutrienti, come l'alimentazione con una dieta ricca di grassi. Successivamente, il contenuto lipidico totale viene isolato mediante estrazione con cloroformio/metanolo, seguita da un'analisi biochimica per trigliceridi e colesterolo. Inoltre, gli epatociti primari di topo sono trattati con glucosio alto più insulina per stimolare l'accumulo di lipidi, un modello in vitro efficiente per imitare l'iperglicemia indotta dalla dieta e l'iperinsulinemia in vivo. Quindi, la deposizione lipidica viene misurata mediante colorazione con olio rosso O ed estrazione con cloroformio/metanolo. La colorazione Oil Red O determina fenotipi steatotici epatici intuitivi, mentre l'analisi dell'estrazione lipidica determina i parametri che possono essere analizzati statisticamente. Gli attuali protocolli sono di interesse per gli scienziati nel campo delle malattie del fegato grasso, dell'insulino-resistenza e del diabete di tipo 2.
Introduzione
L'obesità è un problema di salute in rapida crescita nei paesi sviluppati e in via di sviluppo. E 'stato segnalato per essere una delle condizioni coesistenti frequentemente associati con steatosi epatica non alcolica (NAFLD), con una prevalenza che varia tra il 30 e il 100 per cento in pazienti con NAFLD 1. A causa della forte correlazione tra il fegato grasso e l'obesità, obesi (DIO) modelli murini di dieta-indotta sono ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi molecolari complessi associati con lo sviluppo di NAFLD 2, 3, 4,
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Protocollo
Tutti i protocolli sperimentali su animali sono stati approvati dal comitato di cura degli animali e uso istituzionale presso l'Istituto di Scienze dell'Alimentazione, Istituti di Shanghai per Scienze Biologiche, Accademia Cinese delle Scienze (Shanghai, Cina).
1. DIO modello murino
- alimentazione HFHS
- Feed the otto settimane di età maschile C57BL / 6 topi con una HFHS che contiene 40 kcal% di grassi e 40 kcal% di saccarosio. loro casa a 12 h Condizioni ciclo dark-light.
- Mantenere i topi in HFHS condizione di dieta al seno per quattro a sedici settimane. Controllare il settimanale del ....
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Risultati
Come mostrato in figura 1A, il peso del corpo del mouse è stato aumentato a 45 ± 1,2 g dopo 16 settimane di HFHS alimentazione, che è circa 1,5 volte superiore rispetto al gruppo di alimentazione dieta chow. La composizione corporea NMR analisi mostra la massa grassa e massa magra di topi sono indicati (Figura 1B). Le distribuzioni di grasso del corpo e del fegato sono state determinate mediante MRI, e immagini rappresentative pseudo-colori in vivo, topi.......
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Discussione
NAFLD è una serie di malattie epatiche progressive che è associato con la sindrome metabolica, l'obesità, insulino-resistenza, o diabete mellito tipo 2 (DM2) 11. Il segno distintivo di NAFLD è steatosi, l'accumulo di lipidi negli epatociti. Qui, uno spettro di metodi è presentata per caratterizzare i fenotipi e parametri di steatosi epatica utilizzando topi DIO e epatociti del mouse primarie. Questa procedura potrebbe essere utile per chiarire i meccanismi molecolari di NAFLD e altre mala.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation naturale della Cina (n ° 81.270.930, 31.471.129, e 31.671.224) e le cento talenti del programma della Accademia Cinese delle Scienze (2013OHTP04) a YL
Ringraziamenti
Ringraziamo Feifei Zhang per le utili discussioni. Siamo grati a Jing Gao e Yixuan Sun per l'assistenza tecnica e a Zhengshuai Liu e Fengguang Ma per gli studi sugli animali.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Composto OCT | SAKURA | 4583 | |
| Olio Rosso O Sigma | O0625-25G | ||
| Kit Trigliceridi Infinito | Fisher Kit scientifico | TR22421 | |
| Infinity Colesterolo | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagene tipo I, coda di ratto | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (basso glucosio) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillina / Streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulina | TOCRIS Bioscience | 3435 | sciogliere in PBS, 1 mM per stock |
| Glucosio | Sigma | G8270-100G | |
| Microscopio | Olympus | BX53 | |
| Pompa peristaltica | Longerpump | BT100-2J | |
| Piatto per colture cellulari da 10 cm | Corning | 420167 | |
| Piastra a 6 pozzetti | Corning | 3516 | |
| Saggio BCA | Beyotime | P0010 | |
| Risonanza magnetica nucleare | Tecnologia Niumag | MiniQMR23-060H-I | |
| Dieta ad alto contenuto di grassi e alta surcosa (HFHS) | Diete di ricerca | D12327 |
Riferimenti
- Angulo, P. Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65
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Ristampe e permessi
