ניתוח אופטימלי של<em> In vivo</em> ו<em> במבחנה</em> כבדית steatosis
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
השמנה היא בעיה בריאותית המתפתחת במדינות מפותחות ומתפתחות. זה כבר דווח להיות אחד מחלות רקע קשורה לעיתים קרובות עם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), עם שכיחות הנע בין 30 ל -100 אחוזים בחולים NAFLD 1. בשל הקשר החזק בין כבד שומני והשמנה, שמנים-induced דיאטה (DIO) במודלים של עכברים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים מורכבים הקשורים בפיתוח NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Steatosis כבדיה היא השלב המוקדם של NAFLD, וזה יכול להתקדם steatohepatitis אלכוהולי (NASH), שחמת כבד, ובסופו של דבר, סרטן כבד 7. לכן, המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור מודלים של בעלי חיים ותא של תנאי steatotic בכבד ל- PRפרוטוקולי ovide מפורטים למדידת שומנים יעילה ומדויקת. מודלים ומדידות אלה שימושיים גם עבור החקירה של הפרעות מטבוליות אחרות, כגון עמידות לאינסולין וסוכרת מסוג 2.
כפי מזוהה שמן להיות אחד מגורמי הסיכון המרכזיים עבור NAFLD, א-שומן גבוה, סוכרוז דיאטה (HFHS) המחקה את הדיאטה עתיר שומן בסגנון המערבי משמשת לגרום להשמנה בעכברים. בהמשך לכך, מידת steatosis הכבד ניתן להעריך באמצעות שיטות שונות. ראשית, משקל הגוף וניתוח הרכב הגוף עם תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להראות את הצטברות השומנים במהלך שעת ההאכלה. מסת שומן המסה רזה ניתן לכמת באופן פולשני בזמן אמת.
בנוסף, הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) משמשת כדי להראות הוא את הגוף ואת חלוקת הכבד של שומן. האות בגווני אפור של ניתוח MRI ניתן להמיר תמונה פסאודו צבע קריא, ואת עוצמתאת הגוון האפור והצבע הוא חם לכימות. טכנולוגיה זו מספקת יתרונות ייחודיים למדידת הצטברות שומנים בבעלי חיים. שנית, ניתוח היסטולוגית של הכבד הוא השיטה הנפוצה ביותר כדי לקבוע steatosis בכבד. מכתים Hematoxylin ו Eosin (H & E) מספק מידע היסטולוגית, כגון מורפולוגיה hepatocyte וחדירה מקרופאג, בעוד מכתים האדום O שמן מראה את הגודל והמיקום של טיפות השומנים ב hepatocytes. שלישית, ניתוח תוכן השומנים באמצעות מיצוי כלורופורם / מתנול הוא מדידה מדויקת וכמותית של שומנים בכבד. רמות הטריגליצרידים והכולסטרול סה"כ ניתן למדוד עם שיטות ביוכימיות. חשוב לציין, ניתוח שאיבת שומנים מכתים האדום O שמן יכול לשמש גם מניפולציה גנטית או hepatocytes מטופלים pharmaceutically.
היתרון של השיטה הנוכחית הוא הניצול של גישות אופטימיזציה מרובות כדי ליצור מודלי steatotic כבדיםולאפיין את פנוטיפים הוא in vivo ו במבחנה מקיפה. המודלים העכבר DIO יכול לשחזר את פנוטיפים פתולוגיה מטבולית של מחלת כבד שומני האדם. פרמטרים מטבוליים אחרים בבני אדם ניתן לשכפל במודל זה, כמו גם 8. הדור של מודל hepatocyte steatotic בתגובה גבוהה גלוקוז בתוספת אינסולין יעיל, שימושי, מתגבר על מגבלה של עבודה עכבר זמן רב ויקר. יחדיו, שיטות אלה מספיקות וחיוניים לחקר תפקוד ועמידות לאינסולין שומנים בכבדים במהלך עומס יתר מזין.
Protocol
Representative Results
Discussion
NAFLD היא סדרה של מחלות כבד מתקדמת אשר מזוהה עם תסמונת מטבולית, השמנה, עמידות לאינסולין, או סוכרת סוג 2 (T2DM) 11. המאפיין העיקרי של NAFLD הוא steatosis, הצטברות של שומנים hepatocytes. הנה, קשת של שיטות מוצגת לאפיין את פנוטיפים ופרמטרים של steatosis בכבד באמצעות עכברי DIO ו hepatocytes הע…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
Riferimenti
- Angulo, P. Medical progress – Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
