Analyse optimisée des<em> In Vivo</em> et<em> In vitro</em> Stéatose hépatique

Summary

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Abstract

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.

Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Introduction

L'obésité est un problème de santé en plein essor dans les pays développés et en développement. Il a été rapporté comme étant l' une des conditions coexistant fréquemment associés à la stéatose non alcoolique du foie (stéatose hépatique non alcoolique), avec une prévalence variant entre 30 et 100 pour cent chez les patients NAFLD ^1. En raison de la forte corrélation entre le foie gras et l' obésité, (DIO) modèles induits par l' alimentation de souris obèses sont largement utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires complexes associés au développement de NAFLD ^{2, 3, 4, 5, 6.} La stéatose hépatique est la première étape de NAFLD, et il peut évoluer vers la stéatohépatite non alcoolique (NASH), la cirrhose, et finalement, un cancer du foie ^7. Par conséquent, l'objectif global de cette méthode est de générer des modèles animaux et cellulaires des conditions stéatosiques hépatiques et de provide protocoles détaillés pour la mesure des lipides efficace et précis. Ces modèles et mesures sont également utiles pour l'étude d'autres troubles métaboliques, tels que la résistance à l'insuline et le diabète de type 2.

Comme l'obésité est identifiée comme l'un des principaux facteurs de risque pour la SHNA, une haute teneur en matières grasses, de haute-sucrose alimentation (HFHS) qui imite le style occidental régime riche en graisses est utilisé pour induire l'obésité chez les souris. Par la suite, le degré de stéatose hépatique peut être évaluée à l'aide de différentes méthodes. Tout d'abord, le poids corporel et de l'analyse de la composition corporelle avec la résonance magnétique nucléaire (RMN) montrent l'accumulation de lipides pendant l'heure du repas. La masse grasse et la masse maigre peuvent être quantifiés de façon non invasive et en temps réel.

En outre, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) est utilisée pour montrer à la fois l'ensemble du corps et de la répartition du foie de la graisse. Le signal de niveau de gris de l'analyse de l'IRM peut être convertie en une image lisible en pseudo-couleurs, et l'intensité dele niveau de gris et la couleur est hémi-quantifiable. Cette technologie offre des avantages uniques pour la mesure de l'accumulation des lipides dans les animaux vivants. Deuxièmement, l'analyse histologique du foie est la méthode la plus couramment utilisée pour déterminer la stéatose hépatique. Hématoxyline et à l'éosine (H & E) fournit des informations de coloration histologique, comme une morphologie hépatocytaire et l'infiltration des macrophages, tandis que l'huile rouge O coloration indique la taille et la position des gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes. En troisième lieu, l'analyse de la teneur en lipides par extraction au chloroforme / méthanol est une mesure précise et quantitative des lipides hépatiques. Total des taux de triglycérides et de cholestérol peuvent être mesurés avec des méthodes biochimiques. Fait important, l'analyse de l'extraction des lipides et à l'huile rouge O coloration peuvent également être utilisés dans génétiquement manipulées ou traitées pharmaceutiquement hépatocytes.

L'avantage du présent procédé est son utilisation d'approches multiples optimisées pour générer des modèles de stéatose hépatiqueet de caractériser complètement les phénotypes in vivo et in vitro. Les modèles DIO de souris peuvent récapituler les pathologies métaboliques et phénotypes de la maladie du foie gras humain. D' autres paramètres métaboliques chez l' homme peuvent être reproduits dans ce modèle ainsi ^8. La génération du modèle d'hépatocytes stéatosique en réponse à glucose élevé, plus l'insuline est efficace, utile, et surmonte la limitation des travaux coûteux et fastidieux souris. Pris ensemble, ces méthodes sont suffisantes et indispensables pour l'étude de la dysfonction hépatique des lipides et de la résistance à l'insuline lors de la surcharge des éléments nutritifs.

Protocol

Tous les animaux protocoles expérimentaux ont été approuvés par le soin des animaux et l'utilisation comité institutionnel à l'Institut des sciences de la nutrition, les instituts de Shanghai des sciences biologiques, Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). 1. DIO Modèle de souris HFHS alimentation Nourrir les huit semaines vieux mâle C57BL / 6 avec un HFHS qui contient 40 kcal% de matières grasses et 40 kcal% de saccharose. Ma…

Representative Results

Comme le montre la figure 1A, le poids du corps de la souris a été porté à 45 ± 1,2 g après 16 semaines de HFHS alimentation, qui est d' environ 1,5 fois plus élevée que dans le groupe régime alimentaire chow. La composition corporelle analyses RMN montrant la masse grasse et la masse maigre de souris sont indiqués (figure 1B). La distribution de graisse du corps tout entier et du foie ont été déterminées par IRM, et représentatives d&…

Discussion

NAFLD est une série de maladies hépatiques progressives qui est associée au syndrome métabolique, l' obésité, la résistance à l'insuline, ou diabète de type 2 (DT2) ^11. La caractéristique de NAFLD est stéatose, l'accumulation de lipides dans les hépatocytes. Ici, un éventail de méthodes est présentée pour caractériser les phénotypes et les paramètres de la stéatose hépatique utilisant des souris DIO et les hépatocytes primaires de souris. Cette procédure pourrai…

Materials

O.C.T compound	SAKURA	4583
Oil Red O	Sigma	O0625-25G
Infinity Triglycerides kit	Fisher Scientific	TR22421
Infinity Cholesterol kit	Fisher Scientific	TR13421
Collagen type I, Rat tail	Millipore	08-115
DMEM (low glucose)	Invitrogen	11885-092
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen	15140-122
FBS	Invitrogen	10099141
PBS	cellgro	R21-040-CVR
HBSS	cellgro	20-021-CV
Insulin	TOCRIS Bioscience	3435	dissolve in PBS, 1mM for stock
Glucose	Sigma	G8270-100G
Microscope	Olympus	BX53
Peristaltic pump	Longerpump	BT100-2J
10cm cell culture dish	Corning	420167
6-well-plate	Corning	3516
BCA assay	Beyotime	P0010
Nuclear Magnetic Resonance	Niumag technology	MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet(HFHS)	Research Diets	D12327