יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית
Summary
כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית לסיווג סוגי תאים נוירונים לפני הבידוד ועל אפיון לאחר מכן של transcriptomes תא בודד. פרוטוקול זה מייעל את ההכנה של דגימות עבור רצף RNA מוצלח (RNA-Seq) ומתאר מתודולוגיה שתוכננה במיוחד עבור הבנה משופרת של מגוון הסלולר.
Abstract
גילוי של סמנים ספציפיים סוג תא יכול לספק תובנה לתפקוד הסלולר ואת מקורות ההטרוגניות הסלולרית. עם דחיפה לאחרונה לשיפור ההבנה של המגוון העצבתי, חשוב לזהות גנים אשר הביטוי שלהם מגדיר subpopulations שונים של תאים. הרשתית משמשת מודל מצוין לחקר המגוון של מערכת העצבים המרכזית, שכן היא מורכבת מסוגי תאים רבים. המחקר של כל סוג גדול של תאים הניב סמנים גנטיים המאפשרים זיהוי של אוכלוסיות אלה. עם זאת, תת סוגים מרובים של תאים קיימים בתוך כל אחד אלה הגדולות הכיתות תא הרשתית, ומעטים אלה subtypes יש ידוע סמנים גנטיים, אם כי רבים התאפיינו מורפולוגיה או פונקציה. ידע של סמנים גנטיים עבור תת סוגים ספציפיים ברשתית יאפשר מחקר ומיפוי של מטרות המוח הקשורות פונקציות ויזואליות ספציפיות עשוי גם להשאיל תובנה רשתות הגן כילשמור על מגוון הסלולר. אפיקים עכשוויים המשמשים לזיהוי סמנים גנטיים של תת סוגים יש חסרונות, כגון סיווג של סוגי תאים הבאים רצף. זה מציג אתגר לניתוח נתונים ודורש שיטות אימות קפדניות על מנת להבטיח אשכולות מכילים תאים של אותה פונקציה. אנו מציעים טכניקה לזיהוי מורפולוגיה ופונקציונליות של התא לפני בידוד ורצף, אשר יאפשר זיהוי קל של סמנים ספציפיים משנה. טכניקה זו עשויה להיות מורחבת סוגי תאים שאינם עצביים, כמו גם לאוכלוסיות נדירות של תאים עם וריאציות קלות. פרוטוקול זה מניב נתונים באיכות מעולה, כמו רבים של הספריות סיפקו לקרוא מעמקים גדולים יותר מ 20 מיליון קורא עבור תאים בודדים. מתודולוגיה זו מתגבר על רבים של המכשולים המוצגים על ידי תא יחיד RNA-Seq ועשויים להתאים לחוקרים שמטרתם פרופיל סוגי תאים בצורה פשוטה ויעילה.
Introduction
המגוון העצבתי הוא ציין בכל מערכת העצבים המרכזית, במיוחד הרשתית החולייתיים, רקמה מיוחדת מאוד המורכבת של 1 סוגי גלייה ו 6 תאים עצביים הנובעים מאוכלוסייה אחת של תאים אב רשתית 1 , 2 , 3 . תת סוגים רבים של תאים ניתן לסווג מבחינה תפקודית, מורפולוגית, גנטית. מטרת פרוטוקול זה היא לקשור את השונות הגנטית של סוגי תאים למאפיינים פונקציונליים ו / או מורפולוגיים הניתנים לזיהוי שלהם. מספר גנים זוהו עבור סיווג של תאים, אבל תת סוגים רבים ממשיכים ללכת uncharacterized, כפי שהם מייצגים חלק קטן מכלל האוכלוסייה. זיהוי הגנים בתוך תת-סוגים ספציפיים אלה יאפשר הבנה טובה יותר של המגוון העצבתי בתוך הרשתית ויכול גם לשפוך אור על גיוון של תאים עצביים במקומות אחרים. פוRthermore, תא בודד מאפשר לחשיפת סוגי תאים חדשים, אשר אולי היו overlooked בשל ייצוג נמוך שלהם בקרב האוכלוסייה הכוללת 4 , 5 , 6 , 7 .
אחד היתרונות של transcriptomics תא בודד הוא כי סמנים ייחודיים או שילובים של סמנים המגדירים תת סוג מסוים ניתן לגלות. אלה יכולים לשמש כדי לקבל גישה גנטית לסוג התא עבור מניפולציות שונות. לדוגמה, אנו משתמשים בפרוטוקול זה כדי לאפיין את סוג התא ספציפי גנים של קבוצת משנה של תאים גנגליון ברשתית המבטאים melanopsin photopigment. השימוש בסמן פלואורסצנטי בתאי גנגליון ברשתית מלנופסין מאפשר לחקור את התאים הללו, מכיוון שהם מקובצים יחד בשל הביטוי שלהם לגן ידוע. מעניין, ישנם חמישה subtypes ידוע של תא זה popuLation ברשתית העכבר 8 . לכן, על מנת לבודד RNA מתאי כל סוג, השתמשנו סיווגים מורפולוגיים הוקמה בתוך המודל המהונדס לזהות כל תת סוג לפני בידוד התא. טכניקה זו מאפשרת אפיון של תאים, כמו גם עבור בידוד שלהם ישירות הרשתית, ללא צורך רקמות דיסוציאציה, אשר עלול לגרום לתגובה מתח בתוך תאים זיהום עקב דנדריטים כרותים 9 .
שפע של טכניקות חדשות יש אור לאור בשנים האחרונות כמו שיטת RNA-Seq ממשיכה להתפתח. כלים אלה מאפשרים רכישת תאים מקסימלית ויעילות עלות גבוהה יותר כאשר מתקרבים לשאלה הנדונה 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . עם זאת, בעודטכניקות אלה היו אבני דריכה מעולה, יש מספר משוכות עדיין נתקל כי פרוטוקול זה הוא מסוגל לטפל. ראשית, רבים מהנהלים הנוכחיים מבודדים תאים מרקמות מנותקות ומנסים להשתמש בניתוח רכיבים ראשי או באשכולות הירארכיים פוסט-הוק לקביעת סיווג התא. ההסתמכות על כלים אלה כדי לסווג תת-סוגים לא תניב תוצאות אמינות ותיאלץ למצוא דרכים חדשות לאימות נתונים אלה עבור המתאם של סמן גנטי לסוג פונקציונלי של תאים. הדרישה לדיסוציאציה בפרוטוקולים אחרים עלולה לעיתים לגרום לנזק לרקמות, ועלולה לגרום לנתק תהליכים עצביים, וכתוצאה מכך לאובדן פוטנציאלי של mRNA. יתר על כן, בהכנות התא ניתק, התגובות הלחץ עשוי להתחיל להשפיע על transcriptomes של תאים אלה 14 . פרוטוקול זה מתגבר על אתגרים אלה על ידי קביעת סוג התא פונקציונלי לפני הבידוד, וזה טוב יותר שומרת על חשל התאים על ידי שמירה על רקמת הרשתית ללא פגע.
טכניקה אחת הוצגה בשנת 2014 וכללה ניתוח in vivo של transcriptome של תאים חיים 15 . בעוד טכניקה זו מאפשרת בדיקה של transcriptome עם הפרעה מכנית מינימלית לרקמה, היא חסרה את היכולת לסווג סוגי תאים ספציפיים בתוך הרקמה לפני בחינת transcriptomes שלהם ללא שימוש בעכבר הספציפי מאוד. הפרוטוקול שלנו אינו דורש כתב ספציפי, כפי שאנו לנצל תא מילוי electrophysiology לאפיין תאים לפני הבידוד שלהם. הגבלה נוספת של פרוטוקול זה הקודם היא כי זה דורש אורך גל מסוים כדי לעורר את היסוד photoactivatable, בעוד פרוטוקול שלנו מאפשר שימוש של כתב ניאון וצבע ניאון, אשר זמינים או ניתן לבחור על ידי כל מעבדה בנפרד. עם זאת, מעבדות אחרות יש נשוי שתי שיטות של electrאופיסיולוגיה וטרנסריפטומיקס לחקר המגוון הסלולרי. השימוש של הקלטות מהדק תיקון לאפיין את הפונקציה של התא לפני בידוד שלה בוצעה על נוירונים מנותקים 16 , ובמקרים מסוימים, היא קדמה לשימוש של ניתוח microarray 17 עבור מחקרים אלה. סיבוכים אותו נתקלים גישות אלה, כפי שהם דורשים דיסוציאציה רקמות או שימוש בטכנולוגיה microarray, אשר מסתמך על הכלאה של דגימות בדיקות זמינות. אחד ההתקדמות האחרונה היתה פיתוח של תיקון- Seq, טכניקה המשלבת את השימוש של הקלטות מהדק תיקון וטכנולוגיה RNA-Seq כדי להבין תאים מכל פרוסות המוח כולו 18 . בעוד טכניקה זו יש דמיון שלה לפרוטוקול המוצג כאן, זה שוב חשוב לציין כי הגישה שלנו מאפשרת רקמה להישאר שלמים לבריאות התאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול האופטימיזציהיון של הברית הזאת, אשר מייצר באיכות גבוהה, תא בודד ספריות לשימוש RNA-Seq להשיג עומק קריאה גבוהה כיסוי המיפוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שלנו מדגים, באמצעות מדריך מהיר וקל לשימוש, שיטה להכין תאים בודדים של שיעורים מורפולוגיים מזוהה עבור רצף באיכות גבוהה, עם פגיעה קטנה המדגם. בכתב היד הנוכחי, תאי הגנגליון ברשתית רגישים מבחינה גופנית מאופיינים באופן מורפולוגי, מבודדים ומוכנים ל- RNA-Seq. מדדים סל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להכיר בג'ניפר ביר ועינת שניר, כמו גם במכון האוניברסיטה לגנטיקה אנושית, על עזרתם בהכנת וטיפול בדגימות.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
References
- Austin, C., Cepko, C. L. Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina. Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).
- Masland, R. H. The Neuronal Organization of the Retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
- Rodieck, R. . The First Steps in Seeing. , (1998).
- Chiu, I. M., et al. Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity. Elife. 3, e04660 (2014).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).
- Trapnell, C. Defining cell types and states with single-cell genomics. Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function. J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).
- Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites. Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).
- Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling. Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).
- Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).
- Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
- Qiu, S., et al. Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility. Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).
- Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling. Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).
- Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse. J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes. J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).
- Clontech Laboratories I. . SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina® Sequencing. , (2013).
- Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Schmidt, T. M., et al. A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection. Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification. Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).
- Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons. J. Vis. Exp. , e3824 (2012).
- Trimarchi, J. M., et al. Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
