Одноклеточная РНК-Seq определенных подмножеств клеток сетчатки ганглия
Summary
Здесь мы представляем комбинаторный подход для классификации типов нейронных клеток до выделения и для последующей характеристики одноклеточных транскриптомов. Этот протокол оптимизирует подготовку образцов для успешного секвенирования РНК (РНК-Seq) и описывает методологию, разработанную специально для углубленного понимания клеточного разнообразия.
Abstract
Открытие маркеров, специфичных для типа клеток, может дать представление о клеточной функции и происхождении клеточной гетерогенности. С недавним толчком для лучшего понимания нейронного разнообразия важно идентифицировать гены, экспрессия которых определяет различные субпопуляции клеток. Сетчатка служит отличной моделью для исследования разницы в центральной нервной системе, так как она состоит из нескольких основных типов клеток. Изучение каждого крупного класса клеток дало генетические маркеры, которые облегчают идентификацию этих популяций. Однако в каждом из этих основных классов клеток сетчатки существуют многочисленные подтипы клеток, и лишь немногие из этих подтипов имеют известные генетические маркеры, хотя многие из них характеризуются морфологией или функцией. Знание генетических маркеров для индивидуальных подтипов сетчатки позволило бы изучать и отображать мозговые мишени, связанные со специфическими визуальными функциями, и также может давать представление о генных сетях, которыеПоддерживать клеточное разнообразие. Существующие способы идентификации генетических маркеров подтипов имеют недостатки, такие как классификация типов клеток после секвенирования. Это создает проблему для анализа данных и требует строгих методов проверки, чтобы гарантировать, что кластеры содержат ячейки одной и той же функции. Мы предлагаем метод идентификации морфологии и функциональности клетки до выделения и секвенирования, что позволит более легко идентифицировать маркеры, специфичные для подтипов. Этот метод может быть распространен на не-нейронные типы клеток, а также на редкие популяции клеток с незначительными вариациями. Этот протокол обеспечивает отличное качество данных, так как многие библиотеки обеспечивают глубину чтения более 20 миллионов считываний для отдельных ячеек. Эта методология преодолевает многие из препятствий, представленных одноячеечной РНК-Seq, и может быть подходящей для исследователей, стремящихся к профилированию типов клеток простым и высокоэффективным способом.
Introduction
Разнообразие нейронов наблюдается во всей центральной нервной системе, особенно в сетчатке позвоночных, высокоспециализированной ткани, состоящей из 1 глиального и 6 типов нейронов, которые возникают из одной популяции клеток-предшественников сетчатки 1 , 2 , 3 . Многие подтипы клеток могут быть классифицированы функционально, морфологически и генетически. Цель этого протокола – связать генетическую изменчивость типов клеток с их идентифицируемыми функциональными и / или морфологическими характеристиками. Для классификации клеток было идентифицировано несколько генов, но многие подтипы продолжают оставаться нехарактеризованными, так как они представляют небольшую часть общей популяции. Идентификация генов в этих специфических подтипах позволит лучше понять разнообразие нейронов в сетчатке и может также пролить свет на диверсификацию нервных клеток в других местах. марихуанаБолее того, одноклеточные исследования позволяют выявлять новые типы клеток, которые, возможно, были упущены из-за их низкой представленности среди всего населения 4 , 5 , 6 , 7 .
Одно из преимуществ одноклеточной транскриптомии заключается в том, что можно обнаружить уникальные маркеры или комбинации маркеров, которые определяют конкретный клеточный подтип. Затем они могут быть использованы для получения генетического доступа к этому типу клеток для различных манипуляций. Например, мы используем этот протокол, чтобы охарактеризовать гены определенного типа клеток подмножества клеток сетчатки ганглия, которые экспрессируют фотопигмент меланопсин. Использование флуоресцентного маркера в меланопсин-экспрессирующих ганглиозных клетках сетчатки позволяет исследовать эти клетки, поскольку они сгруппированы вместе из-за их экспрессии известного гена. Интересно, что существует пять известных подтипов этой ячейки popuВ сетчатке мыши 8 . Таким образом, для выделения РНК из клеток каждого типа мы использовали установленные морфологические классификации в трансгенной модели для идентификации каждого подтипа до выделения клеток. Этот метод позволяет характеризовать клетки, а также их выделение непосредственно из сетчатки, без необходимости диссоциации тканей, что может вызвать стресс-реакцию внутри клеток и загрязнение из-за разъединенных дендритов 9 .
За последние несколько лет появилось множество новых методов, поскольку метод РНК-Seq продолжает развиваться. Эти инструменты позволяют добиться максимальной мобильности клеток и большей эффективности затрат при приближении к вопросу 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Однако, хотяЭти методы были отличными ступенями, существует ряд препятствий, которые все еще встречаются, с которыми этот протокол способен справиться. Во-первых, многие из нынешних процедур изолируют клетки от диссоциированной ткани и пытаются использовать либо основной компонентный анализ, либо иерархическую кластеризацию post-hoc для определения классификации клеток. Опираясь на эти инструменты для классификации подтипов, может не дать надежных результатов и может заставить искать новые способы проверки этих данных для корреляции генетического маркера с функциональным типом клетки. Требование диссоциации в других протоколах может иногда приводить к повреждению тканей и может приводить к отделению нейрональных процессов, что приводит к потенциальной потере мРНК. Кроме того, в диссоциированных клеточных препаратах стрессовые реакции могут начинать влиять на транскриптомы этих клеток 14 . Этот протокол преодолевает эти трудности, определяя тип функциональных клеток до изоляции, и он лучше поддерживает hЗа счет сохранения целостности ткани сетчатки.
Один метод был введен в 2014 году и состоял из анализа in vivo транскриптома живых клеток 15 . Хотя этот метод позволяет исследовать транскриптом с минимальным механическим разрушением ткани, ему не хватает способности классифицировать определенные типы клеток в ткани до исследования их транскриптомов без использования очень специфической мыши-репортера. Наш протокол не требует специального репортера, так как мы используем заполнение клеток и электрофизиологию для характеристики клеток перед их изоляцией. Другим ограничением этого предыдущего протокола является то, что он требует определенной длины волны для возбуждения фотоактивируемого элемента, тогда как наш протокол позволяет использовать флуоресцентный репортер и флуоресцентный краситель, которые легко доступны или могут быть выбраны каждой лабораторией индивидуально. Тем не менее, другие лаборатории вышли замуж заOphysiology и transcriptomics для изучения клеточного разнообразия. Использование патч-зажимных записей для характеристики функции клетки до ее изоляции было выполнено на диссоциированных нейронах 16, а в некоторых случаях предшествовало использование анализа микрочипов 17 для этих исследований. Этими подходами сталкиваются те же самые осложнения, поскольку они требуют диссоциации тканей или использования технологии микрочипов, которая основана на гибридизации образцов с доступными зондами. Одним из последних достижений является разработка Patch-Seq, метода, который сочетает использование патч-зажимных записей и технологию RNA-Seq для понимания клеток из цельных мозговых срезов 18 . Хотя этот метод имеет сходство с протоколом, представленным здесь, снова важно отметить, что наш подход позволяет ткани оставаться неповрежденным для здоровья клеток. Здесь мы представляем протокол для optimizatКоторый создает высококачественные одноячеечные библиотеки для использования РНК-Seq для получения высокой глубины считывания и покрытия карт.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наш протокол демонстрирует с помощью быстрого и простого в использовании руководства метод подготовки отдельных клеток определенных морфологических классов для высококачественного секвенирования с небольшим ущербом для образца. В настоящей рукописи, собственно фоточувствительны?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы выразить благодарность Дженнифер Баир и Эйнату Снир, а также Институту Генетики Университета Айовы за их помощь в подготовке и обработке образцов.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
References
- Austin, C., Cepko, C. L. Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina. Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).
- Masland, R. H. The Neuronal Organization of the Retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
- Rodieck, R. . The First Steps in Seeing. , (1998).
- Chiu, I. M., et al. Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity. Elife. 3, e04660 (2014).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).
- Trapnell, C. Defining cell types and states with single-cell genomics. Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function. J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).
- Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites. Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).
- Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling. Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).
- Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).
- Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
- Qiu, S., et al. Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility. Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).
- Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling. Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).
- Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse. J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes. J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).
- Clontech Laboratories I. . SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina® Sequencing. , (2013).
- Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Schmidt, T. M., et al. A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection. Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification. Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).
- Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons. J. Vis. Exp. , e3824 (2012).
- Trimarchi, J. M., et al. Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
