Sequenza RNA a singola cellula di sottogruppi definiti delle cellule del Ganglio retinico
Summary
Qui presentiamo un approccio combinatorio per la classificazione di tipi di cellule neuronali prima dell'isolamento e per la successiva caratterizzazione di transcriptomi a singola cellula. Questo protocollo ottimizza la preparazione di campioni per il successo RNA Sequencing (RNA-Seq) e descrive una metodologia studiata appositamente per una migliore comprensione della diversità cellulare.
Abstract
La scoperta di marcatori specifici di tipo cellulare può fornire approfondimenti sulla funzione cellulare e sulle origini dell'eterogeneità cellulare. Con una recente spinta per una migliore comprensione della diversità neuronale, è importante identificare i geni la cui espressione definisce diverse sottopopolazioni di cellule. La retina serve come modello eccellente per lo studio della diversità del sistema nervoso centrale, in quanto è composto da più tipi di cellule principali. Lo studio di ogni grande classe di cellule ha prodotto marcatori genetici che facilitano l'identificazione di queste popolazioni. Tuttavia, in ciascuna di queste principali classi di cellule retiniche esistono più sottotipi di cellule e pochi di questi sottotipi hanno conosciuto marcatori genetici, anche se molti sono stati caratterizzati da morfologia o funzione. Una conoscenza di marcatori genetici per singoli sottotipi retinici consentirebbe lo studio e la mappatura di obiettivi cerebrali correlati a funzioni visive specifiche e possono anche dare un'occhiata alle reti geniche cheMantenere la diversità cellulare. I canali attuali utilizzati per identificare i marcatori genetici di sottotipi sono in grado di avere dei problemi, come la classificazione dei tipi di cellule dopo la sequenza. Questo rappresenta una sfida per l'analisi dei dati e richiede rigorosi metodi di convalida per garantire che i cluster contengano celle della stessa funzione. Proponiamo una tecnica per identificare la morfologia e la funzionalità di una cellula prima dell'isolamento e del sequenziamento, che consentirà una più facile identificazione di marcatori specifici di sottotipo. Questa tecnica può essere estesa a tipi di cellule non neuronali, così come a rare popolazioni di cellule con variazioni minori. Questo protocollo produce dati di eccellente qualità, poiché molte delle librerie hanno fornito profondità di lettura superiori a 20 milioni di letture per singole celle. Questa metodologia supera molti degli ostacoli presentati da RNA singolo-Seq e può essere adatto a ricercatori che mirano a profilare i tipi di cellule in modo semplice e altamente efficiente.
Introduction
La diversità neuronale è osservata in tutto il sistema nervoso centrale, in particolare nella retina vertebrata, un tessuto altamente specializzato costituito da 1 ipo e 6 cellule neuronali che sorgono da una popolazione di cellule progenitrici retiniche 1 , 2 , 3 . Molti sottotipi di cellule possono essere classificati funzionalmente, morfologicamente e geneticamente. L'obiettivo di questo protocollo è quello di legare la variabilità genetica dei tipi cellulari alle loro caratteristiche funzionali e / o morfologiche identificabili. Sono stati identificati alcuni geni per la classificazione delle cellule, ma molti sottotipi continuano a non identificarsi, in quanto rappresentano una piccola frazione della popolazione complessiva. L'identificazione dei geni all'interno di questi sottotipi specifici consentirà una maggiore comprensione della diversità neuronale all'interno della retina e può anche dare luce sulla diversificazione delle cellule neurali altrove. FuInoltre, studi a cellule singole consentono di scoprire nuovi tipi di cellule, che possono essere trascurati a causa della loro bassa rappresentazione tra la popolazione complessiva 4 , 5 , 6 , 7 .
Uno dei vantaggi della transcriptomics a singola cellula è che si possono scoprire marcatori o combinazioni di marcatori che definiscono un particolare sottotipo cellulare. Questi possono quindi essere utilizzati per ottenere l'accesso genetico a quel tipo di cellule per diverse manipolazioni. Ad esempio, stiamo usando questo protocollo per caratterizzare i geni specifici di una cellula di un sottogruppo di cellule del ganglio retinico che esprimono la melanopsina fotopigmenta. L'uso di un marker fluorescente nelle cellule gangliari retiniche che esprimono melanopsina consente lo studio di queste cellule, in quanto sono raggruppate insieme a causa della loro espressione di un gene noto. È interessante notare che ci sono cinque sottotipi noti di questo popu cellulareNella retina del topo 8 . Quindi, per isolare RNA dalle cellule di ogni tipo, abbiamo utilizzato classificazioni morfologiche stabilite all'interno del modello transgenico per identificare ogni sottotipo prima dell'isolamento cellulare. Questa tecnica consente la caratterizzazione delle cellule così come il loro isolamento direttamente dalla retina, senza la necessità di dissociazione tissutale, che può causare una risposta di stress all'interno delle cellule e la contaminazione dovuta a dendriti interrotti 9 .
Negli ultimi anni sono venuti alla luce una moltitudine di nuove tecniche in quanto il metodo RNA-Seq continua a svilupparsi. Questi strumenti consentono l'acquisizione di celle ottimizzate e l'efficienza dei costi più elevata mentre si avvicina alla domanda a portata di mano 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Tuttavia, mentreQueste tecniche sono state eccellenti pietre da scalare, ci sono un certo numero di ostacoli ancora incontrati che questo protocollo è in grado di affrontare. In primo luogo, molte delle procedure in corso isolano le cellule dal tessuto dissociato e tenteranno di utilizzare l'analisi dei componenti principali o la clustering gerarchica post-hoc per determinare la classificazione cellulare. Basandosi su questi strumenti per classificare i sottotipi non può produrre risultati affidabili e può costringere uno a trovare nuovi modi per convalidare questi dati per la correlazione di un marcatore genetico a un tipo di cellula funzionale. Il requisito per la dissociazione in altri protocolli può talvolta determinare danni ai tessuti e può causare la rottura dei processi neuronali, con conseguente perdita potenziale di mRNA. Inoltre, nelle preparazioni cellulari dissociate, le reazioni di stress possono cominciare ad influenzare i transcriptomi di queste cellule 14 . Questo protocollo supera queste sfide determinando il tipo di cellule funzionali prima dell'isolamento e meglio mantiene l'hEalth delle cellule mantenendo intatte il tessuto retinico.
Una tecnica è stata introdotta nel 2014 e consisteva nell'analisi in vivo del transcriptoma delle cellule vive 15 . Mentre questa tecnica consente l'esame del trascrittome con minima disfunzione meccanica al tessuto, manca la capacità di classificare tipi specifici di cellule all'interno del tessuto prima di esaminare i loro transcriptomi senza utilizzare un mouse reporter molto specifico. Il nostro protocollo non richiede un reporter specifico, in quanto utilizziamo il riempimento delle cellule e l'elettrofisiologia per caratterizzare le cellule prima del loro isolamento. Un'altra limitazione di questo precedente protocollo è che richiede una lunghezza d'onda specifica per eccitare l'elemento fotoattivatabile, mentre il nostro protocollo consente l'uso di un reporter fluorescente e di coloranti fluorescenti, facilmente accessibili o scelti da ciascun laboratorio singolarmente. Ancora, altri laboratori hanno sposato i due metodi di elettrOphysiology e transcriptomics per lo studio della diversità cellulare. L'uso di registrazioni di patch-clamp per caratterizzare la funzione di una cellula prima del suo isolamento è stato eseguito sui neuroni dissociati 16 e, in alcuni casi, ha preceduto l'uso di analisi microarray 17 per questi studi. Le stesse complicanze sono incontrate da quegli approcci, in quanto richiedono la dissociazione tissutale o l'uso di tecnologia microarray, che si basa sull'ibridazione di campioni alle sonde disponibili. Uno degli sviluppi più recenti è stato lo sviluppo di Patch-Seq, una tecnica che combina l'uso delle registrazioni patch-clamp e della tecnologia RNA-Seq per capire le cellule dalle fette del cervello intero 18 . Mentre questa tecnica ha le sue somiglianze con il protocollo presentato qui, è ancora importante notare che il nostro approccio consente al tessuto di rimanere intatto per la salute delle cellule. Qui presentiamo un protocollo per l'ottimizzazioneIone di questa alleanza, che genera librerie a celle singole di alta qualità per l'utilizzo di RNA-Seq per ottenere una copertura di profondità e mappatura elevata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro protocollo dimostra, attraverso una guida rapida e facile da usare, un metodo per preparare singole celle di classi morfologiche identificate per sequenziamenti di alta qualità, con poca lesione al campione. Nel presente manoscritto, le cellule gangliari retiniche intrinsecamente fotosensibili sono caratterizzate morfologicamente, isolate e preparate per RNA-Seq. Sforzi cellulari possono verificarsi durante la movimentazione della retina; Per questo motivo sostituiamo ogni pezzo di tessuto dopo non più di 4 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere Jennifer Bair e Einat Snir, nonché l'Istituto universitario di Iowa per la genetica umana, per la loro assistenza nella preparazione e gestione di campioni.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
References
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