هنا، يقدم بروتوكول (MitoCeption) لنقل الميتوكوندريا، معزولة عن الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (MSC)، إلى خلايا ورم أرومي الجذعية (GSC)، بهدف دراسة التأثيرات البيولوجية على GSC الأيض ووظائف. ويمكن تكييف بروتوكول مماثل لنقل الميتوكوندريا بين أنواع الخلايا الأخرى.
الميتوكوندريا تلعب دورا محوريا لاستقلاب الخلية، وإنتاج الطاقة والسيطرة على موت الخلايا المبرمج. وقد تم العثور على وظيفة الميتوكوندريا عدم كفاية مسؤولة عن أمراض متنوعة جدا، بدءا من الأمراض العصبية والسرطان. ومن المثير للاهتمام، وقد ثبت الميتوكوندريا مؤخرا لعرض القدرات على أن يتم تحويلها بين أنواع الخلايا، وخاصة من الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (MSC) إلى الخلايا السرطانية في ظروف coculture، مع عواقب والتمثيل الغذائي والوظيفية للخلايا الميتوكوندريا المتلقي، ومواصلة تعزيز الاهتمام الحالي لالخصائص البيولوجية لهذه العضيات.
تقييم الآثار المترتبة على الميتوكوندريا MSC المنقولة في الخلايا المستهدفة هي من الأهمية بمكان لفهم نتائج البيولوجية لهذه التفاعلات خلية خلية. بروتوكول MitoCeption الموصوفة هنا يسمح بنقل الميتوكوندريا المعزولة مسبقا من الخلايا المانحة إلى الخلايا المستهدفة، وذلك باستخدام MSC الميتوكوندرياوالخلايا الجذعية ورم أرومي (GSC) كنظام نموذج. وقد سبق استخدام هذا البروتوكول لنقل الميتوكوندريا، معزولة عن اللجان الدائمة، لمتمسكا الخلايا السرطانية MDA-MB-231. ويتم تكييف هذا البروتوكول نقل الميتوكوندريا هنا لGSCs التي تقدم خصوصية محددة من تنامي كما neurospheres في المختبر. نقل الميتوكوندريا المعزولة يمكن اتباعها من قبل مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) والتصوير متحد البؤر باستخدام الميتوكوندريا الأصباغ الحيوية. استخدام الميتوكوندريا المانحة والهدف الخلايا مع النسخ المتنوعة مميزة (النيوكلوتايد) كما يتيح الكشف عن الميتوكوندريا نقل على أساس تركيز الحمض النووي التعميم الخاصة بهم (و mtDNA) في الخلايا المستهدفة. مرة واحدة وقد تم التحقق من صحة بروتوكول مع هذه المعايير، فإن خلايا إيواء الميتوكوندريا نقل يمكن تحليلها لتحديد الآثار المترتبة على الميتوكوندريا الخارجية على الخصائص البيولوجية مثل استقلاب الخلية، والمطاوعة، وانتشار واستجابة للعلاج.
الميتوكوندريا هي عضيات توجد في الخلايا حقيقية النواة حيث أنها تلعب دورا رئيسيا في امتصاص المواد الغذائية وكذلك في إنتاج الطاقة والأيض. هذه العضيات تحتوي على الحمض النووي دائرية (و mtDNA)، 16.6 كيلوبايت طويل، الذي يشفر البروتينات المجمعات سلسلة نقل الإلكترون، tRNAs وrRNAs 1. وظيفة هذه العضيات هو أمر حاسم لارتبطت توازن الخلايا والعديد من الأمراض مع الميتوكوندريا اختلال وظيفي 1، 2، 3. وعلى سبيل المثال تم ربط مركز الميتوكوندريا إلى التهاب والأمراض المعدية والسرطان، في هذه الحالة الأخيرة مع عواقب للورم خبيث ومقاومة للعلاج 4، 5، 6، 7.
الميتوكوندريا عرض القدرة اللافتة ل الحصول على نقلها بين "المانحة" وخلايا "الهدف". وهذا يؤدي إلى تغييرات في عملية الأيض نشطة من الخلايا المستهدفة وكذلك في التعديلات الفنية الأخرى مثل إصلاح الأنسجة ومقاومة للعوامل العلاج الكيميائي، كما هو مبين في الآونة الأخيرة من قبل مختلف المختبرات 8، 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15 16. الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (اللجان الدائمة) تعرض هذه القدرة على نقل الميتوكوندريا إلى مجموعة واسعة من الخلايا المستهدفة، بما في ذلك العضلية، والخلايا البطانية، الرئوية الخلايا الظهارية السنخية، والخلايا أنبوبي كلوي والخلايا السرطانية، مما أدى إلى إدخال تعديلات على الخصائص الوظيفية لهذه الخلايا 8،> 9، 10، 12، 17، 18.
يبدو الصرف الميتوكوندريا الآن كآلية المستخدمة على نطاق واسع أن تسمح لعدد من أنواع مختلفة من الخلايا على التواصل مع بعضها البعض، وتعديل خصائصها البيولوجية. يمكن أن يحدث هذا التبادل الميتوكوندريا من خلال نفق الأنابيب النانوية (تي ان تي) تشكيل، التي تنطوي على connexin 43 التي تحتوي على تقاطعات الفجوة 8 أو M-ثانية / TNFaip2 وexocyst المعقدة 19. بدلا من ذلك، تم عرض نقل الميتوكوندريا أيضا أن بوساطة arrestin microvesicles التي تحتوي على نطاق البروتين 1 بوساطة (ARMMs) 20. ومن المثير للاهتمام، وارتبط فعالية نقل الميتوكوندريا إلى معدل تعبير عن رو GTPase 1 MIRO1 21، عاملا رئيسيا لتفسير الاختلافات في كفاءات نقل الميتوكوندريا بين iPSC-اللجان الدائمة والكبار BM-اللجان الدائمة 22.
وعلى الرغم من هذه الثروة من البيانات المتعلقة الصرف الميتوكوندريا خلية إلى خلية، لا يعرف إلا القليل نسبيا عن التمثيل الغذائي ونتائج البيولوجية لهذا النقل الميتوكوندريا. وبالتالي، فإنه يستحق تماما وضع الأدوات المناسبة لإجراء تقييم كامل للآثار البيولوجية من هذا النقل. على مر السنين، العديد من الطرق التقنية لنقل الميتوكوندريا من الجهات المانحة للخلايا متقبل وقد اقترحت. وهذا يشمل الحقن المباشر للالميتوكوندريا في البويضات 23، 24، 25، انصهار الخلية لتوليد cybrids transmitochondrial 26، 27 ومؤخرا، نقل الميتوكوندريا المعزولة باستخدام ضوئي؛ ضوحراري nanoblades 28.
نحن وآخرون أظهرت سابقا قدرة mitochond معزولةريا على أن يكون داخليا من قبل الخلايا الحية، كما لوحظ على حد سواء في التجارب المختبرية والحية 29، 30، 31، من خلال الآليات المقترحة لإشراك macropinocytosis 32. نحن تطويرها وسيلة، ودعا MitoCeption، لنقل الكمية الميتوكوندريا المعزولة (من اللجان الدائمة) لاستهداف الخلايا، كما يتضح مع (ملتصقة) MDA-MB-231 سرطان الثدي خط الخلية 31. وقد تم تكييف هذا البروتوكول هنا لنقل معزولة الميتوكوندريا MSC الإنسان إلى خلايا ورم أرومي الجذعية (GSCs).
ورم أرومي والأورام الخبيثة العدوانية من الدماغ الذي أصبح سريعا مقاومة للعلاج، ويرجع ذلك أساسا إلى خلايا ورم أرومي الجذعية (GSC) الموجودة داخل الورم 33. تنمو هذه GSCs كما neurospheres في المختبر، وتوليد أورام في نماذج طعم أجنبي. الخلايا السرطانية داخل ورم أرومي لديهاالقدرة على إجراء اتصالات خلية إلى خلية، كما هو مبين في الآونة الأخيرة لخلايا نجمي ورم في المخ المتصلة بعضها ببعض عبر microtubes الموسعة، التي من خلالها الميتوكوندريا (وكذلك الكالسيوم وخلية نوى) يمكن أن تهاجر، مما أدى إلى شبكات نجمي مقاومة للعلاج بالأشعة 34. ورم أرومي يمكن تجنيد العديد من الخلايا المختلفة داخل المكروية ورم، بما في ذلك اللجان الدائمة 35 و 36. أظهرنا أن اللجان الدائمة يمكن إجراء اتصالات خلية خلية مع GSCs في coculture ونقل الميتوكوندريا الخاصة بهم (لا تظهر البيانات)، التي من المتوقع أن تعديل الخصائص الفنية GSC. يصف هذا البروتوكول كيف تقنية MitoCeption يمكن استخدامها لنقل الميتوكوندريا، قبل معزول من اللجان الدائمة الإنسان، إلى GSCs البشرية بهدف تحديد نتائج البيولوجية الوظيفية. تم استخدام متعدد القدرات ومكون للأورام للغاية خط Gb4 GSC 37 في هذه الدراسة.
تظهر عددا متزايدا من الدراسات أن الخلايا يمكن تبادل الميتوكوندريا وأن هذه الميتوكوندريا يكون لها آثار عميقة على استقلاب الخلية المستهدفة وظائف. لذلك، لا بد من السيطرة على أدوات لنقل الكمية الميتوكوندريا من الخلايا المانحة لهذه الخلايا المستهدفة لتمكين دراسة دقيقة…
The authors have nothing to disclose.
نشكر اندريا Parmeggiani (L2C وDIMNP، مونبلييه) وبينوا CHARLOT (IES، مونبلييه) وكذلك أعضاء المختبر لإجراء مناقشات مفيدة، كريستوف Duperray للمساعدة في تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، ومونبلييه منشأة RIO التصوير (MRI) لتوفير بيئة ملائمة لنظام مراقبة الأصول الميدانية والفحص المجهري متحد البؤر. وأيد البنك المركزي الماليزي من خلال زمالة الدراسات العليا من LabEx Numev (اتفاقية وكالة الاستخبارات الوطنية-10-LABX 20). وأيد AB من قبل الزمالة الجامعية من جامعة وارسو والاتحاد الأوروبي (رقم POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV هو عالم موظفين من المركز الوطني للبحث العلمي (CNRS).
Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 |
N-2 Supplement (100X) | Fisher Scientific | 11520536 |
B-27 Supplement W/O VIT A (50X) | Fisher Scientific | 11500446 |
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 |
poly Heme | Sigma | P3932 |
aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F |
DMEM/F-12 without glutamine, | Fisher Scientific | 11540566 |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 |
Glucose | Sigma | G7021 |
Insuline | Sigma | I 1882 |
Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 |
Human EGF | Peprotech | AF-100-15 |
Heparin | Sigma | H3149 |
CaCl2 | MERCK | 2382 |
Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 |
DNase I | SIGMA | 10104159001 |
Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 |
Trypsin | Gibco | 15090-046 |
Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 |
Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F |
Fungine | Invivogen | ant-fn-1 |
Fungizone | Thermofisher | 15290018 |
Gentamycin | Euromedex | EU0410 |
MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 |
MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 |
MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 |
CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 |
CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 |
RIPA | Santa Cruz | sc-24948 |
FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 |
FACS apparatus | Gallios | 3L 10C |
LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |