MitoCeption: Trasferimento isolato umana MSC mitocondri di Glioblastoma cellule staminali

Summary

Qui, un protocollo (MitoCeption) viene presentato per trasferire i mitocondri, isolato dalle cellule staminali mesenchimali umane (MSC), alle cellule staminali di glioblastoma (GSC), con l'obiettivo di studiare i loro effetti biologici sul metabolismo e le funzioni di GSC. Un protocollo simile può essere atto a trasferire mitocondri tra altri tipi di cellule.

Abstract

I mitocondri hanno un ruolo centrale per il metabolismo cellulare, la produzione di energia e il controllo dell'apoptosi. Inadeguata funzione mitocondriale è stato trovato responsabile di malattie molto diverse, che vanno da patologie neurologiche al cancro. È interessante notare che i mitocondri sono stati recentemente dimostrato per visualizzare la capacità di essere trasferiti tra i tipi di cellule, in particolare da cellule staminali mesenchimali umane (MSC) per le cellule tumorali in condizioni di co-coltura, con metabolici e funzionali conseguenze per le cellule riceventi mitocondri, migliorando ulteriormente l'attuale interesse per le proprietà biologiche di questi organelli.

Valutazione degli effetti della mitocondri MSC trasferito nelle cellule bersaglio è di primaria importanza per comprendere l'esito biologica di tali interazioni cellula-cellula. Il protocollo MitoCeption qui descritto permette il trasferimento dei mitocondri isolati preventivamente dalle cellule donatrici alle cellule bersaglio, utilizzando MSC mitocondrie le cellule staminali di glioblastoma (GSC) come sistema modello. Questo protocollo è stato in precedenza utilizzato per trasferire i mitocondri, isolato da MSC, a aderenti cellule tumorali MDA-MB-231. Questo protocollo di trasferimento dei mitocondri è adattato qui per GSCs che presentano la particolarità specifica di crescere come neurosfere in vitro. Il trasferimento dei mitocondri isolati può essere seguita da cellule di fluorescenza-attivato (FACS) e confocale utilizzando mitocondri coloranti vitali. L'uso di cellule donatrici e di destinazione mitocondri con aplotipi distinte (SNP) consente anche il rilevamento dei mitocondri trasferiti in base alla concentrazione di DNA mitocondriale circolare (mtDNA) nelle cellule bersaglio. Una volta che il protocollo è stato convalidato con questi criteri, le cellule che ospitano mitocondri trasferiti possono essere ulteriormente analizzati per determinare gli effetti dei mitocondri esogeni sulle proprietà biologiche quali il metabolismo cellulare, la plasticità, la proliferazione e la risposta alla terapia.

Introduction

I mitocondri sono organelli presenti nelle cellule eucariotiche dove svolgono un ruolo centrale nel assorbimento dei nutrienti, nonché nella produzione di energia e metaboliti. Questi organelli contengono circolare DNA mitocondriale (mtDNA), lunga 16,6 kb, che codifica le proteine dei complessi della catena di trasporto degli elettroni, tRNA e rRNA ^1. La funzionalità di questi organelli è fondamentale per l'omeostasi cellulare e diverse patologie sono stati associati con mitocondri disfunzioni ^{1, 2, 3.} Lo stato mitocondri è ad esempio stato colleg....

Protocol

Giorno 1

1. Etichettatura della cellula staminali mesenchimali (MSC) mitocondri (opzionale)

1. Due giorni prima della preparazione mitocondri, sementi MSC umane in un piatto di coltura 100 mm, in 10 ml αMEM / FBS 10%, in modo da avere 4 x 10 ⁵ cellule staminali mesenchimali in coltura al giorno 1.
2. Risciacquare con PBS MSC (4 ml) e aggiungere 4 ml αMEM / FBS 1% (preriscaldata a 37 ° C).
3. Aggiungere la quantità necessaria di mitocondri colorante vitale e incubare le cellule per 30 min in incubatore a 37 °.
4. Rimuovere la soluzione colorante mitocondri, lavare le cellule due volte con 4 ml preriscal....

Results

Le fasi procedurali che delinea l'isolamento dei mitocondri da cellule staminali mesenchimali (MSC) e il loro trasferimento alle cellule staminali di glioblastoma mirati (GSC) da MitoCeption sono mostrati in Figura 1. GSCs sono le cellule staminali tumorali coltivate come neurosfere di preservare la loro proprietà delle cellule staminali. Per il protocollo, GSCs vengono seminati come singole cellule di un paio d'ore prima del trasferimento dei mitocondri (punto 3) per co.......

Discussion

Un numero crescente di studi dimostrano che le cellule possono scambiare i mitocondri e che questi mitocondri avere effetti profondi sul metabolismo delle cellule bersaglio e funzioni. Pertanto, è indispensabile la conoscenza dei mezzi per trasferire quantitativamente mitocondri delle cellule del donatore a queste cellule bersaglio per consentire uno studio accurato dei loro effetti biologici.

Il protocollo qui descritto è stato originariamente elaborato per trasferire i mitocondri isolati d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di isolamento dei mitocondri per i tessuti	Fisher Scientific
Integratore N-2 (100x)	Fisher Scientific	11520536
B-27 Integratore W/O VIT A (50x)	Fisher Scientific
HBSS senza Ca2+ senza Mg2+	Sigma	H4385
poli eme	Sigma	P3932
aMEM senza glutammina	Ozyme	BE12-169F
DMEM / F-12 senza glutammina	Fisher Scientific
L-glutammina	Invitrogen	Codice 25030-024
Glucosio	Sigma	G7021
Insulina	Sigma	I 1882
Umano  bFGF	R& D Systems	233-FB-025
EGF umano	Peprotech	AF-100-15
Eparina	Sigma	H3149
CaCl2	MERCK	2382
Inibitore della tripsina	Sigma	T9003
DNase I	SIGMA
tripsina 0,25% / EDTA 1  mM	Invitrogen
Tripsina	Gibco	15090-046
Inibitori della proteasi Senza EDTA	Sigma	4693159001
Ciprofloxacine	Sigma	17850-5G-F
Fungine	Invivogen	ant-fn-1
Fungizone	Thermofisher	15290018
Gentamicina	Euromedex	EU0410
MitoTracker Sonde	molecolari	M7514
Sonde molecolari	CMXRos rosse	M7512
MitoTracker Sonde molecolari FM rosso intenso		M22426
Sonde molecolari	CMFDA verdi	C7025
Sonde molecolari	CMF2HC blu	C12881
RIPA	Santa Cruz	sc-24948
FluoroDish Piatto di coltura sterile World	Precision Instruments	Ematocitometro FD35-100
	Fisher Scientific	267110
Tubi FACS	Beckman Coulter	2.523.749
Apparecchio FACS	Gallios	3L 10C
LC AVVIO RAPIDO DNA MASTER PLUS	Roche	3515885001