MitoCeption: Trasferimento isolato umana MSC mitocondri di Glioblastoma cellule staminali
Summary
Qui, un protocollo (MitoCeption) viene presentato per trasferire i mitocondri, isolato dalle cellule staminali mesenchimali umane (MSC), alle cellule staminali di glioblastoma (GSC), con l'obiettivo di studiare i loro effetti biologici sul metabolismo e le funzioni di GSC. Un protocollo simile può essere atto a trasferire mitocondri tra altri tipi di cellule.
Abstract
I mitocondri hanno un ruolo centrale per il metabolismo cellulare, la produzione di energia e il controllo dell'apoptosi. Inadeguata funzione mitocondriale è stato trovato responsabile di malattie molto diverse, che vanno da patologie neurologiche al cancro. È interessante notare che i mitocondri sono stati recentemente dimostrato per visualizzare la capacità di essere trasferiti tra i tipi di cellule, in particolare da cellule staminali mesenchimali umane (MSC) per le cellule tumorali in condizioni di co-coltura, con metabolici e funzionali conseguenze per le cellule riceventi mitocondri, migliorando ulteriormente l'attuale interesse per le proprietà biologiche di questi organelli.
Valutazione degli effetti della mitocondri MSC trasferito nelle cellule bersaglio è di primaria importanza per comprendere l'esito biologica di tali interazioni cellula-cellula. Il protocollo MitoCeption qui descritto permette il trasferimento dei mitocondri isolati preventivamente dalle cellule donatrici alle cellule bersaglio, utilizzando MSC mitocondrie le cellule staminali di glioblastoma (GSC) come sistema modello. Questo protocollo è stato in precedenza utilizzato per trasferire i mitocondri, isolato da MSC, a aderenti cellule tumorali MDA-MB-231. Questo protocollo di trasferimento dei mitocondri è adattato qui per GSCs che presentano la particolarità specifica di crescere come neurosfere in vitro. Il trasferimento dei mitocondri isolati può essere seguita da cellule di fluorescenza-attivato (FACS) e confocale utilizzando mitocondri coloranti vitali. L'uso di cellule donatrici e di destinazione mitocondri con aplotipi distinte (SNP) consente anche il rilevamento dei mitocondri trasferiti in base alla concentrazione di DNA mitocondriale circolare (mtDNA) nelle cellule bersaglio. Una volta che il protocollo è stato convalidato con questi criteri, le cellule che ospitano mitocondri trasferiti possono essere ulteriormente analizzati per determinare gli effetti dei mitocondri esogeni sulle proprietà biologiche quali il metabolismo cellulare, la plasticità, la proliferazione e la risposta alla terapia.
Introduction
I mitocondri sono organelli presenti nelle cellule eucariotiche dove svolgono un ruolo centrale nel assorbimento dei nutrienti, nonché nella produzione di energia e metaboliti. Questi organelli contengono circolare DNA mitocondriale (mtDNA), lunga 16,6 kb, che codifica le proteine dei complessi della catena di trasporto degli elettroni, tRNA e rRNA 1. La funzionalità di questi organelli è fondamentale per l'omeostasi cellulare e diverse patologie sono stati associati con mitocondri disfunzioni 1, 2, 3. Lo stato mitocondri è ad esempio stato collegato a infiammazione, malattie infettive e cancro, in quest'ultimo caso con conseguenze per metastasi e la resistenza alla terapia 4, 5, 6, 7.
I mitocondri mostrano la notevole capacità di ottenendo trasferiti tra "donatore" e le cellule "target". Questo porta a cambiamenti nel metabolismo energetico delle cellule bersaglio così come in altre modifiche funzionali come riparazione dei tessuti e la resistenza agli agenti chemioterapici, come recentemente dimostrato da diversi laboratori 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC) mostrano questa capacità di trasferire mitocondri per una grande varietà di cellule bersaglio, tra cui cardiomiociti, cellule endoteliali, polmonari alveolari cellule epiteliali, cellule tubulari renali e cellule tumorali, portando a modifiche delle proprietà funzionali di queste cellule 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
scambio mitocondri ora appare come un meccanismo ampiamente diffuso che consente un certo numero di diversi tipi di cellule di comunicare tra loro e modificare le loro proprietà biologiche. Questo scambio mitocondri può avvenire attraverso la formazione di tunneling nanotubi (TNT), che coinvolge connessina 43 contenenti gap giunzioni 8 o M-Sec / TNFaip2 e la exocyst complessi 19. In alternativa, il trasferimento mitocondri è stato anche dimostrato di essere mediata da arrestina microvescicole dominio contenente la proteina 1-mediata (ARMMs) 20. È interessante notare che l'efficacia del trasferimento mitocondri era legato al tasso espressione della Rho GTPasi 1 MIRO1 21, un fattore chiave per spiegare le differenze di efficacies trasferimento mitocondri tra iPSC-MSC e adulti BM-MSC 22.
Nonostante questa ricchezza di dati riguardanti lo scambio mitocondri cella-a-cella, relativamente poco si sa circa il metabolismo e l'esito biologica di questo trasferimento mitocondri. Pertanto, si giustifica pienamente la creazione di strumenti adeguati per valutare appieno gli effetti biologici di questo trasferimento. Nel corso degli anni, vari approcci tecnici per trasferire mitocondri dal donatore al cellule accettori sono stati proposti. Ciò comprende iniezione diretta di mitocondri in ovociti 23, 24, 25, fusione cellulare per generare cibridi transmitocondriali 26, 27 e, più recentemente, il trasferimento di mitocondri isolati utilizzando fototermico nanoblades 28.
Noi e gli altri precedentemente dimostrato la capacità di mitochond isolatoria essere internalizzati dalle cellule viventi, come osservato sia in vitro che in vivo 29, 30, 31, attraverso meccanismi proposti di comportare macropinocitosi 32. Abbiamo sviluppato inoltre un metodo, chiamato MitoCeption, trasferire quantitativamente mitocondri isolati (da MSC) per colpire le cellule, come esemplificato con il (aderenti) MDA-MB-231 linea di cellule di cancro al seno 31. Questo protocollo è stato adattato qui per il trasferimento di isolati mitocondri MSC umani per le cellule staminali di glioblastoma (GSC).
Glioblastoma sono tumori maligni aggressivi del cervello che diventano rapidamente resistente al trattamento, soprattutto per le cellule staminali di glioblastoma (GSC) presenti all'interno del tumore 33. Questi GSCs crescere come neurosfere in vitro e generare tumori in modelli di xenotrapianto. Le cellule tumorali all'interno glioblastoma hanno lacapacità di effettuare connessioni cellula-cellula, come recentemente dimostrato per le cellule tumorali del cervello astrocitari che interconnettono con microtubi estesi, attraverso cui i mitocondri (così come nuclei di calcio e cellulari) possono migrare, con conseguente reti astrocitoma radioterapia resistenti 34. Glioblastoma può reclutare molte cellule diverse all'interno del microambiente tumorale, tra cui MSC 35, 36. Abbiamo dimostrato che cellule staminali mesenchimali possono effettuare connessioni cellula-cellula con GSCs in co-coltura e trasferire i loro mitocondri (dati non mostrati), che si prevede di modificare GSC proprietà funzionali. Il presente protocollo descrive come la tecnica MitoCeption può essere utilizzato per trasferire i mitocondri, preventivamente isolato da cellule staminali mesenchimali umane, a GSCs umani con lo scopo di determinare l'esito biologico funzionale. Il multipotenti e altamente oncogeno linea GB4 GSC 37 è stato utilizzato in questo studio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un numero crescente di studi dimostrano che le cellule possono scambiare i mitocondri e che questi mitocondri avere effetti profondi sul metabolismo delle cellule bersaglio e funzioni. Pertanto, è indispensabile la conoscenza dei mezzi per trasferire quantitativamente mitocondri delle cellule del donatore a queste cellule bersaglio per consentire uno studio accurato dei loro effetti biologici.
Il protocollo qui descritto è stato originariamente elaborato per trasferire i mitocondri isolati…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Andrea Parmeggiani (L2C e DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), così come i membri del laboratorio per le discussioni utili, Christophe Duperray per un aiuto con l'analisi FACS, l'impianto di imaging RIO Montpellier (MRI) per la fornitura del ambiente adeguato per FACS e microscopia confocale. BNM è stato sostenuto da una borsa di studio di laurea dal LABEX Numev (convenzione ANR-10-LabX-20). AB è stato sostenuto da una borsa di studio di laurea presso l'Università di Varsavia e dell'Unione Europea (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV è uno scienziato del personale del Centro nazionale per la ricerca scientifica (CNRS).
Materials
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 |
| N-2 Supplement (100X) | Fisher Scientific | 11520536 |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50X) | Fisher Scientific | 11500446 |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 |
| poly Heme | Sigma | P3932 |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F |
| DMEM/F-12 without glutamine, | Fisher Scientific | 11540566 |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 |
| Glucose | Sigma | G7021 |
| Insuline | Sigma | I 1882 |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| CaCl2 | MERCK | 2382 |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 |
| Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
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