애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부
Summary
여기서 우리는 제브라 피쉬 섹스의 분화 및 유지 보수의 조사를 용이하게 애벌레 제브라 피쉬의 성선 조직을 분리하기위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
야생 제브라 피쉬는 ZZ / ZW 성 결정 시스템을 가지고 있지만, 길 들여진 제브라 피쉬는 성 염색체를 잃었다. 그들은 게놈가 공동으로 개별 물고기의 성 정체성을 결정 전반에 걸쳐 여러 유전자가 분산 polygenic 성 결정 시스템을 활용합니다. 현재 유전자는 생식소의 발달을 조절에 관여하고 작동 방법이 어려운 남아있다. 일반적으로, 성선 조직을 분리하는 것은 성 발달 과정을 조사하기위한 첫 번째 단계입니다. 여기서 우리는 zebrafish의 유충 DPF (17) DPF (일 포스트 수정) 25에서 성선 조직을 분리하는 방법을 제시한다. 분리 된 성선 조직은 연속적 형태 및 유전자 발현 프로파일 링에 의해 조사 할 수있다.
Introduction
야생 제브라 피쉬 염색체 4의 주요 여성 성 결정은 1 (즉, 일반적인 실험실 균주)를 분실하거나 들여진 제브라 피쉬에서 수정됩니다. 대신, 그들은 온도, 저산소증, 식품 가용성 및 인구 밀도 등 환경 요인에 의해 동행 polygenic 성 결정 시스템을 가지고있다. 제브라 피쉬 성 개발의 상세한 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 일차 성 판정 신호 (들) / 무엇 이러한 제브라 성 결정이 발생한 경우 등의 근본적인 문제가 있으며, 유전자 생식선 변환의 제 1 단계는, (3) 2 답변 남아 조절한다.
제브라 피쉬 성 개발의 과정에서 몇 가지 중요한 단계로 인식되고있다. 개발의 초기 단계에서, 4 HPF (시간 포스트 수정) 원시 생식 세포 (PGC와) 사양을 받아야에서 시작 생식기 능선 마이그레이션 및분아 증식. PGC 번호와 생식 세포와 체세포 사이의 상호 작용은 생식선 차별화 4 중요하다. 13 DPF (일 포스트 수정)에서, 생식선은 미분화 단계에 있습니다. 17 DPF으로 생식선 미래의 여성과 남성 모두에서 양방향 가능성이 난소로 발전. 난소에서 세포 사멸에 의존 전환은 고환에 21 ~ 25 DPF에서 시작하고 몇 주 동안 계속 사용할 수 있습니다. DPF (35)에 의해 상기 생식선의 성별 결정된 성별 별 생식 생산 7 양쪽 난소에서 진행되고, 6, 5 고환.
지금까지 다양한 후보 유전자 및 성 결정 메커니즘이 제안되었다. 단백질 체학 및 transcriptomic 분석은 성적으로 동종 이형 표현으로 많은 유전자를 격리하고 이들 유전자는 제브라 피쉬 (8)에서 성 차별을 연구하기 위해 사용되어왔다 </sup> 9,10. 예를 들면, 애벌레 제브라에서 cyp19a1a 유전자 특이 아니라 고환 (11), (12) 난소 표현된다. 또한 AMH 유전자 약하게 난소 난포 과립 막 세포에서 발현되지만 강하게 정소 세르 톨리 세포 (13)이다. 반대로, 바사 유전자가 지속적으로 적합한 생식선 마커 (14), (15) 제조, 남녀 모두 지브라 피쉬의 생식 세포에서 발현된다.
생식선 유전자 발현 량을 조사하는 것은, 특히 양방향 전위 난소 단계 3, 9에 결정 성 및 분화의 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다. 그러나 애벌레 제브라 피쉬와 상응 작은 생식선의 작은 크기 gonada의 분리를 복잡하게추가로 분자 분석을위한 조직 L. 사용 이전의 연구는 opercula 항문 구멍 (16) 사이에 전체 트렁크 영역을 해부. 이 준비는 포함 생식선 있지만, 여러 조직과 기관으로 구성되어 있습니다. 대안 적으로, 바사 같은 성선 GFP 특이 식 트랜스 제닉 동물 : EGFP는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)과 레이저 캡처 마이크로 해부 (17), (18)를 통하여 생식선 조직의 분리를 위해 사용 하였다. 그러나 그들의 광범위한 응용이 제한됩니다. 여기, 우리는 17 DPF 25 DPF에서 애벌레 제브라 피쉬에서 성선 조직을 분리하는 간단한 절차를 설명합니다. 우리는 다른 기관에 대한 생식선의 위치를 보여 주변 조직에서 형태 학적 손상 생식선을 격리 할 것. 우리는 더 높은 정량 PCR을 통해 트렁크 조직 (과 비교 고립 된 생식선로 표현 등 바사와 cyp19a1a과 생식선 특정 유전자를 보여qPCR에) 분석. 본 프로토콜은 이에 생식기 조직 (19)의 연속적인 분자 분석을 가능하게 식별, 분리, 정제 및 RNA 유생 지브라 피쉬의 생식선 특정 유전자의 증폭을 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제브라 피쉬는 강력한 모델이되었다 광범위하게 개발 및 질병 관련 연구에 사용됩니다. 뇌, 심장, 생식선, 신장 등의 성인 제브라 피쉬에서 기관의 분리를위한 방법은,도 23, 24, 25를 기록하고있다. 때문에 작은 크기와 애벌레 제브라 피쉬의 성선 조직의 역동적 인 리모델링에, 성선 조직의 분리가 어려운 작업입니다. 애벌레 생…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 물고기 케어 C 장 감사합니다. 이 작품은 중국 국가 자연 과학 재단 (GP로 31171074, 31371099 및 31571067)에 의해 그리고 포강 인재 프로젝트 (GP에 09PJ1401900)에 의해 지원되었다.
Materials
| Cell culture dish 100 mm | Corning | 430167 | For embryo incubation |
| 20 X EM | For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O. | ||
| 1 X EM | Dilute 20 X EM in distilled water | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | For preparing the 2% agar plates |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | For RNA isolation |
| Meter glass | Shen Bo | 250 ml | For preparing the 2% agar plates |
| Microwave Oven | Midea | M1-211A | For heating the AGAR |
| TWEEZER DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | For dissection |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ168 | For dissection |
| Pure water equipment | Millipore | ||
| Ringer’s solution | For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container. | ||
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Metal bath | QiLinbeier | Model GL-150 | |
| Microscope | Leica | M205 FA | For photomicrograph |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micro Scale RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | For RNA isolation from gonad tissues |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | For DNA digestion in the RNA solution |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | #K1631 | For first-strand cDNA synthesis |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | For digesting the residual RNA in the cDNA solution. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and applicable for intercalation assay with SYBR Green I. |
| Spectrophotometer | Ne Drop | OD-2000+ | Measuring the concentration of the total RNA |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | gene expression profiling |
Riferimenti
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