La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue

Summary

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare il tessuto gonadico di zebrafish larvale, che faciliterà le indagini della differenziazione sessuale zebrafish e manutenzione.

Abstract

Anche se zebrafish selvatici in possesso di un / ZW determinazione del sesso ZZ, zebrafish addomesticato hanno perso il cromosoma sessuale. Essi utilizzano un sistema di determinazione del sesso poligenica, in cui diversi geni distribuiti in tutto il genoma determinare collettivamente le identità sessuali di singoli pesci. Attualmente, i geni coinvolti nella regolazione dello sviluppo delle gonadi e come funzionano rimangono sfuggente. Normalmente, isolando tessuto gonadico è il primo passo per esaminare i processi di sviluppo del sesso. Qui vi presentiamo una procedura per isolare il tessuto gonadico da 17 dpf (giorni dopo la fecondazione) e 25 dpf larve di zebrafish. Il tessuto gonadico isolato può essere successivamente esaminati dalla morfologia e l'espressione genica.

Introduction

Il principale determinante del sesso femminile nel selvaggio cromosoma zebrafish 4 è perso o modificato nel zebrafish addomesticato (vale a dire i ceppi più comuni di laboratorio) ^1. Al contrario, hanno un sistema di determinazione del sesso poligenica accompagnato da fattori ambientali come la temperatura, l'ipossia, la disponibilità di cibo e la densità di popolazione. I meccanismi dettagliati dello sviluppo sessuale zebrafish non sono pienamente compresi. Domande fondamentali come quando si verifica determinazione del sesso zebrafish, ciò che il segnale determinazione sessuale primaria (s) è / sono, e quali geni regolano il primo passo di trasformazione gonadi restano da risolvere ^{2, 3.}

Nel processo di sviluppo sessuale zebrafish, più tappe importanti sono state riconosciute. Nella fase iniziale di sviluppo, a partire dal 4 HPF (ore dopo la fecondazione) cellule germinali primordiali (PGC) sottoporsi specifica, migrazione cresta genitale eproliferazione. Numeri PGC e interazioni reciproche tra cellule germinali e cellule somatiche sono importanti per gonadi differenziazione ^4. A 13 dpf (giorni dopo la fecondazione), le gonadi sono in fase indifferenziata. Con 17 DPF, le gonadi si sviluppano in ovaie bi-potenziali in entrambi i maschi e femmine futuri. La transizione apoptosi dipendente da ovaio al testicolo inizio alle 21 a 25 dpf e può continuare per diverse settimane. Da 35 dpf, il sesso della gonade è stata determinata e produzione di gameti sesso-specifico è in corso in entrambe le ovaie e testicoli ^{5, 6, 7.}

Fino ad oggi, sono stati proposti diversi geni candidati ei meccanismi di determinazione del sesso. Proteomica e analisi trascrittomica hanno isolato molti geni con espressione dimorfismo sessuale e questi geni sono stati utilizzati per studiare la differenziazione del sesso in zebrafish ^8, </sup> ^{9, 10.} Ad esempio, in zebrafish larvale, il gene cyp19a1a è specificamente espresso nelle ovaie, ma non nel testicolo ^{11, 12.} Inoltre, gene amh è debolmente espressa nelle cellule follicolo granulosa ovarica, ma fortemente nei testicoli cellule di Sertoli ^13. Al contrario, gene vasa continuamente espresso nelle cellule germinali sia zebrafish maschile e femminile, che lo rendono adatto marcatore gonadi ^{14, 15.}

Indagare gonadici livelli di espressione genica è fondamentale per capire il meccanismo molecolare di determinazione del sesso e la differenziazione soprattutto nella fase ovaie bi-potenziale ^{3, 9.} Tuttavia, le piccole dimensioni delle zebrafish larvale e corrispondentemente piccole gonadi complicare l'isolamento di gonadal tessuti per ulteriori analisi molecolari. Precedenti studi utilizzati sezionati tutta la regione del tronco tra l'opercoli e pori anale ^16. Questa preparazione, anche se contenenti gonadi, costituito da più tessuti e organi. In alternativa, gli animali transgenici con espressione GFP specifico gonade come vasa: EGFP sono stati usati per l'isolamento tessuto gonadico mediante fluorescenza delle cellule attivate (FACS) e la cattura laser micro-dissezione ^{17, 18.} Ma la loro applicazione diffusa è limitata. Qui, descriviamo una semplice procedura per isolare il tessuto gonadico da zebrafish larvale a 17 dpf e 25 dpf. Dimostriamo la posizione delle gonadi rispetto ad altri organi e isolare le gonadi morfologicamente intatte dai tessuti circostanti. Mostriamo ulteriormente i geni specifici gonade come vasa e cyp19a1a sono altamente espresso nelle gonadi isolate rispetto al tessuto tronco tramite PCR quantitativa (qPCR) analisi. Il presente protocollo permette l'identificazione, l'isolamento, la purificazione dell'RNA e l'amplificazione di geni specifici gonadici da zebrafish larvale, consentendo così successiva analisi molecolare del tessuto gonadica ^19.

Protocol

Esperimenti zebrafish sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Fudan University. Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo le procedure standard 20. 1. preparativi Coltivare 17 dpf e 25 dpf zebrafish larvale Trasferimento 2 maschi e 2 femmine zebrafish adulti (in buona salute, da 3 a 6 mesi di età, di laboratorio AB strain) ad un serbatoio traversata nel tardo pomeriggio prima del giorno traversata. Separare…

Representative Results

Dissezioni delle gonadi sono state effettuate su AB strain zebrafish larvale. La figura 1 mostra tessuto tipico gonadi di zebrafish larvale a 17 dpf e 25 dpf. In primo luogo, la pelle ei muscoli di un lato dell'addome viene tagliato per esporre gli organi interni. Dopo aver rimosso la massa degli organi interni, la vescica natatoria insieme gonade rimangono nel bagagliaio. Gonade era attaccato alla faccia ventrale vescica natatoria (freccia in <strong cl…

Discussion

Il pesce zebra è diventato un modello potente ed è ampiamente utilizzato nello sviluppo e nella ricerca sulle malattie correlate. I metodi per l'isolamento degli organi in zebrafish adulti come il cervello, il cuore, gonadi, e del rene, sono stati ben documentati ^{23, 24, 25.} A causa delle piccole dimensioni e rimodellamento dinamica dei tessuti gonadici nella zebrafish larvale, isolamento di tessuto gonadico è un compito…

Materials

Cell culture dish 100 mm	Corning	430167	For embryo incubation
20 X EM			For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O.
1 X EM			Dilute 20 X EM in distilled water
AGAROSE G-10	Gene	121985	For preparing the 2% agar plates
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026	For RNA isolation
Meter glass	Shen Bo	250 ml	For preparing the 2% agar plates
Microwave Oven	Midea	M1-211A	For heating the AGAR
TWEEZER DUMONT#5INOX	World Precision Instrument	500341	For dissection
Stereomicroscope	Motic	SMZ168	For dissection
Pure water equipment	Millipore
Ringer’s solution			For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container.
Transfer pipette	Samco	202, 204
Metal bath	QiLinbeier		Model GL-150
Microscope	Leica	M205 FA	For photomicrograph
Centrifuge	Eppendorf	5417R
Micro Scale RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	For RNA isolation from gonad tissues
Dnase I	Sigma	AMPD1-1KT	For DNA digestion in the RNA solution
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	#K1631	For  first-strand cDNA synthesis
Rnase H	Thermo Scientific	#EN0202	For digesting the residual RNA in the cDNA solution.
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and  applicable for intercalation assay with SYBR Green I.
Spectrophotometer	Ne Drop	OD-2000+	Measuring the concentration of the total RNA
Mastercycler	Eppendorf	AG 22331 Hamburg	gene expression profiling