Die Induktion einer entzündlichen Reaktion in der Primär Hepatozyten-Kulturen von Mäusen
Summary
Hier zeigen wir eine enzymatische Annäherung an primären Hepatozyten aus erwachsenen Mäusen zu isolieren, und wir beschreiben die Quantifizierung einer Entzündungsreaktion mittels ELISA und real-time PCR.
Abstract
Die Leber spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation der systemischen Entzündung. Bei chronischen Nierenerkrankungen insbesondere reagiert die Leber in Reaktion auf die urämischen milieu, oxidativer Stress, Endotoxämie und die verminderte Clearance von proinflammatorischen Zytokinen Zirkulieren durch eine große Anzahl von Akute-Phase-Reaktanden zu erzeugen. Experimentelle Werkzeuge zum Studium der Entzündung und die darunter liegende Rolle der Hepatozyten sind entscheidend für die Regulation und der Beitrag der hepatischen Zytokine zu einer systemischen Akutphasenreaktion und eine verlängerte proinflammatorischen Szenario, insbesondere in einer komplizierten Einstellung wie chronischer Nierenkrankheit zu verstehen. Seit dem Studium bieten komplexen Mechanismen der Entzündung in vivo bleibt eine Herausforderung, ressourcenintensiv und erfordert in der Regel die Verwendung von transgenen Tieren, primäre Hepatozyten isoliert ein robustes Werkzeug mechanistische Einblicke in die Leberakutphase – Antwort zu erhalten. Da diese in vitro – Technik zu moderaten Kosten, hohen WiederHerstellbarkeit und gemeinsame technische Wissen, primäre Hepatozyten isoliert auch als Screening-Ansatz leicht verwendet werden kann. Hier beschreiben wir eine enzymatische basierte Methode primären murinen Hepatozyten zu isolieren, und wir beschreiben die Beurteilung einer Entzündungsreaktion in diesen Zellen mittels ELISA und quantitative real-time PCR.
Introduction
Chronischer Nierenerkrankung (CKD) kann als ein Zustand von akuten und chronischen Entzündungs 1 definiert werden. Bei Patienten mit CKD, die Serumspiegel des phosphaturic Hormon Fibroblasten – Wachstumsfaktor 23 (FGF23) steigen progressiv um Serum Phosphathomöostase 2 zu halten. Erhöhte Serum FGF23 Ebenen unabhängig mit kardiovaskulären Morbidität und Mortalität bei Patienten in Zusammenhang gebracht , die eine Hämodialyse – Behandlung beginnen , 3, 4. Außerdem haben mehrere klinische Studien eine starke Korrelation zwischen erhöhten FGF23 Ebenen und die Serumspiegel von C-reaktivem Protein (CRP), Interleukin-6 (IL-6) und Tumor – Nekrose – Faktor α (TNF & agr;) , 5, 6 gezeigt. Darüber hinaus wird in einer experimentellen Studie haben wir gezeigt, vor kurzem, dass FGF23 direkt Hepatozyten ausrichten können und verursachen eine entzündliche Reaktion durch eine Erhöhung CRP und IL-6 production in der Leber 7. FGF23 könnte daher wirken als zirkulierende Faktor, systemische Entzündung in CKD beiträgt.
In den frühen 70er Jahren, waren primäre Hepatozyten isoliert und untersucht zum ersten Mal 8. Seitdem primären kultivierten wurden Leberzellen verwendet worden , um ausgiebig 9 metabolische Verarbeitung, Hormonfunktion, Arzneimittel – Metabolismus und Toxizität sowie Immunität und entzündliche Reaktionen zu untersuchen, 10. Vorherige Protokolle wurden in erster Linie die enzymatische Isolierung von primären Hepatozyten aus menschlichem Lebergewebe 11, 12 beschrieben. Während ein hervorragendes Modell, lässt dies die Fähigkeit heraus zu untersuchen, wie die genetische Manipulation komplexer Lebersignalmechanismen sowie funktionelle Konsequenzen auf verschiedene Arten von Stimuli beeinflusst. Im Folgenden beschreiben wir die Isolierung von murinen primären Hepatozyten. Bemerkenswert ist , kann die Wirkung mehrerer Mediatoren der Leber Akute-Phase – Reaktion, wie beispielsweise Lipopolysaccharid (LPS), IL-6 und FGF23 in eine einfache, schnelle und reproduzierbare Weise 13 analysiert werden.
Hier stellen wir ein Protokoll für die enzymatische Trennung von Hepatozyten von erwachsenen Mäusen, und wir zeigen, dass etablierte Induktoren von Entzündungen, wie beispielsweise LPS und IL-6, sowie neuartige Entzündungsmediatoren wie FGF23, direkt Expression stimulieren kann und Sekretion von inflammatorische Zytokine, wie CRP und IL-6 in kultivierten Hepatozyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolierung von primären Hepatozyten von Mäusen ist ein schnelles, kostengünstiges und zuverlässiges Werkzeug Entzündungsreaktionen ex vivo zu untersuchen. Wenn es richtig durchgeführt wird, können die Ergebnisse leicht in einer fristgerechten und kosteneffiziente Art und Weise erzeugt und reproduziert werden. Die folgenden Punkte sollten sorgfältig, um eine erfolgreiche Trennung zu gewährleisten, beurteilt werden.
Der chirurgische Einschnitt und die Kanülierung de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die NIH (R01HL128714 zu CF) und (F31DK10236101 KS) und der American Heart Association (CF und AG) unterstützt.
Materials
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers – Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
Riferimenti
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