A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos
Summary
Aqui, mostramos uma abordagem enzimática para isolar hepatócitos primários a partir de ratos adultos, e descreve-se a quantificação de uma resposta inflamatória por meio de ELISA e PCR em tempo real.
Abstract
O fígado desempenha um papel decisivo na regulação da inflamação sistêmica. Na doença renal crónica, em particular, o fígado reage em resposta ao meio urémico, o stress oxidativo, endotoxemia e a diminuição da depuração da circulando citocinas pró-inflamatórias através da produção de um grande número de reagentes de fase aguda. ferramentas experimentais para estudar a inflamação eo papel subjacente dos hepatócitos são cruciais para compreender a regulação ea contribuição de citocinas hepáticas a uma resposta de fase aguda sistêmica e um cenário pró-inflamatória prolongada, especialmente em um ambiente complexo, tais como doença renal crónica. Uma vez que o estudo dos mecanismos complexos de inflamação in vivo permanece um desafio, uso intensivo de recursos e geralmente requer a utilização de animais transgénicos, hepatócitos isolados primários fornecer uma ferramenta robusta para obter insights mecanísticos para a resposta de fase aguda hepática. Desde esta técnica in vitro apresenta custos moderados, alta reprodutibilidade e conhecimento técnico comum, hepatócitos isolados primários podem também ser facilmente usados como uma abordagem de triagem. Aqui, nós descrevemos um método baseado em enzimática para isolar os hepatócitos primários de murino, e que descrevem a avaliação de uma resposta inflamatória nestas células usando ELISA e quantitativa PCR em tempo real.
Introduction
Doença renal crónica (IRC) pode ser definida como um estado de inflamação aguda e crónica 1. Em pacientes com DRC, os níveis séricos do fator fosfatúrico hormona de crescimento de fibroblastos 23 (FGF23) aumentará progressivamente, a fim de manter a homeostase do fosfato sérico 2. Níveis FGF23 soro aumentados estão independentemente associadas com morbidade e mortalidade cardiovascular entre os pacientes que estão começando o tratamento de hemodiálise 3, 4. Além disso, vários estudos clínicos demonstraram uma correlação entre os níveis elevados e FGF23 níveis séricos de proteína C-reactiva (CRP), interleucina-6 (IL-6) e Tumor Necrosis Factor de α (TNFa) 5, 6. Além disso, em um estudo experimental, que demonstraram recentemente que FGF23 pode ter como alvo directamente hepatócitos e causa uma resposta inflamatória, aumentando PCR e IL-6 Produção no fígado 7. Assim, FGF23 pode atuar como um fator circulante que contribui para a inflamação sistêmica em CKD.
No início dos anos 70, os hepatócitos primários foram isolados e estudados pela primeira vez 8. Desde então, as células hepáticas cultivadas primárias têm sido amplamente utilizados para examinar transformação metabólica, função hormonal, o metabolismo de drogas e toxicidade, bem como a imunidade e respostas inflamatórias 9, 10. Protocolos anteriores descreveram-se principalmente o isolamento enzimático de hepatócitos primários a partir de tecido de figado humano 11, 12. Enquanto um excelente modelo, este deixa de fora a possibilidade de estudar como a manipulação genética afeta os mecanismos de sinalização hepática complexos, bem como consequências funcionais sobre diferentes tipos de estímulos. No que se segue, descreve-se o isolamento de hepatócitos primários de murino. Notavelmente, o efeito de vários mediadores da resposta de fase aguda hepática, tais como lipopolissacáridos (LPS), IL-6 e FGF23 podem ser analisadas de uma forma fácil, rápida e reprodutível 13.
Este trabalho apresenta um protocolo para o isolamento enzimático de hepatocitos de ratos adultos, e que demonstram que os indutores estabelecidos de inflamação, tais como LPS e IL-6, bem como novos mediadores inflamatórios, tais como FGF23, pode estimular directamente a expressão e secreção de citoquinas inflamatórias, tais como PCR e IL-6 em hepatócitos em cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolamento de hepatócitos primários a partir de ratinhos é uma ferramenta rápido, barato e fiável para estudar as respostas inflamatórias ex vivo. Se realizado corretamente, os resultados podem ser facilmente gerada e reproduzida de forma atempada e eficiente. Os seguintes pontos devem ser cuidadosamente avaliada, a fim de garantir um isolamento bem sucedido.
A incisão cirúrgica ea canulação da VCI deve ser realizada sob anestesia geral e não após a eutanásia. Um invest…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH (R01HL128714 para CF) e (F31DK10236101 para KS) e da American Heart Association (CF e AG).
Materials
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers – Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
Riferimenti
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