L'induction d'une réponse inflammatoire dans les cultures hépatocytes primaires de souris
Summary
Ici, nous montrons une approche enzymatique pour isoler des hépatocytes primaires de souris adultes, et nous décrivons la quantification d'une réponse inflammatoire par ELISA et la PCR en temps réel.
Abstract
Le foie joue un rôle décisif dans la régulation de l'inflammation systémique. Dans la maladie rénale chronique, en particulier, le foie réagit en réponse au milieu urémique, le stress oxydatif, l'endotoxémie et la diminution de la clairance de la circulation cytokines pro-inflammatoires par la production d'un grand nombre de réactifs de phase aiguë. inflammation des outils expérimentaux pour étudier et le rôle sous-jacent des hépatocytes sont cruciales pour comprendre la régulation et la contribution des cytokines hépatiques à une réponse en phase aiguë systémique et un scénario pro-inflammatoire prolongée, en particulier dans un cadre complexe comme la maladie rénale chronique. Depuis l' étude des mécanismes complexes de l' inflammation in vivo reste difficile, de ressources et nécessite généralement l'utilisation d'animaux transgéniques, les hépatocytes isolés primaires constituent un outil robuste pour acquérir des connaissances mécanistes dans la réponse de phase aiguë hépatique. Cette technique in vitro comporte des coûts modérés, élevés reproductibilité et de la connaissance technique commune, hépatocytes isolés primaires peuvent également être facilement utilisé comme une approche de dépistage. Ici, nous décrivons une méthode enzymatique basée à isoler les hépatocytes primaires de souris, et on décrit l'évaluation d'une réponse inflammatoire dans ces cellules en utilisant la méthode ELISA et la PCR quantitative en temps réel.
Introduction
L' insuffisance rénale chronique (CKD) peut être définie comme un état d'inflammation aiguë et chronique 1. Chez les patients atteints de néphropathie chronique, les niveaux de l'hormone de croissance des fibroblastes facteur phosphaturique 23 (FGF23) sériques augmentent progressivement afin de maintenir l' homéostasie du phosphate sérique 2. Niveaux de FGF23 sérique accrus sont indépendamment associés à la morbidité et la mortalité cardiovasculaire chez les patients qui commencent un traitement d'hémodialyse 3, 4. En outre, plusieurs études cliniques ont montré une forte corrélation entre les niveaux de FGF23 élevés et des niveaux de protéine C-réactive (CRP), l' interleukine-6 (IL-6) et facteur de nécrose tumorale α (TNF) 5, 6 sérum. En outre, dans une étude expérimentale, nous avons récemment démontré que FGF23 peut cibler directement les hépatocytes et provoquer une réponse inflammatoire en augmentant la CRP et l'IL-6 production dans le foie 7. Par conséquent, le FGF23 pourrait agir comme un facteur de circulation qui contribue à l'inflammation systémique CKD.
Dans les années 70, les hépatocytes primaires ont été isolées et étudiées pour la première fois 8. Depuis lors , les cellules hépatiques en culture primaire ont été largement utilisées pour étudier la transformation métabolique, de la fonction hormonale, le métabolisme des médicaments et de la toxicité, ainsi que l' immunité et les réponses inflammatoires 9, 10. Protocoles précédents ont principalement décrit l'isolement enzymatique des hépatocytes primaires à partir de tissus de foie humain 11, 12. Alors un excellent modèle, ce qui laisse la possibilité d'étudier la façon dont la manipulation génétique affecte les mécanismes de signalisation hépatique complexes ainsi que des conséquences fonctionnelles sur différents types de stimuli. Dans ce qui suit, nous décrivons l'isolement des hépatocytes primaires murins. Notamment, l'effet de plusieurs médiateurs de la réponse de phase aiguë hépatique, comme le lipopolysaccharide (LPS), IL-6 et FGF23 peut être analysé d'une manière facile, rapide et reproductible 13.
Ici, nous présentons un protocole pour l'isolement enzymatique des hépatocytes de souris adultes et nous démontrons que les inducteurs établies de l'inflammation, tels que le LPS et l'IL-6, ainsi que des médiateurs inflammatoires nouveaux tels que le FGF23, peuvent stimuler directement l'expression et la sécrétion de les cytokines inflammatoires, telles que la CRP et IL-6 dans des hépatocytes cultivés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isoler hépatocytes primaires de souris est un outil rapide, peu coûteux et fiable pour étudier les réponses inflammatoires ex vivo. Si effectué correctement, les résultats peuvent être facilement générés et reproduits en temps opportun et rentable. Les points suivants doivent être évalués avec soin afin d'assurer une isolation efficace.
L'incision chirurgicale et de la canulation de la VCI doivent être effectuées sous anesthésie générale et non pas après l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le NIH (R01HL128714 à CF) et (F31DK10236101 à KS) et l'American Heart Association (CF et AG).
Materials
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers – Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
Riferimenti
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