Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تلألؤ بيولوجي والقريبة من تحت الحمراء التصوير من التهاب العصب البصري والمخ التهاب في نموذج EAE من مرض التصلب العصبي المتعدد في الفئران

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55321
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Summary

وتبين لنا تقنية لفي الجسم الحي تلألؤ بيولوجي الحية والأشعة تحت الحمراء القريبة التصوير من التهاب العصب البصري والتهاب الدماغ في النموذج التجريبي التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (بنت) لمرض التصلب المتعدد في الفئران SJL / J.

Abstract

التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (بنت) في SJL / J الفئران هو نموذج للتحويل بين التصلب المتعدد الانتكاس (RRMS). عشرات EAE السريرية واصفا العجز وظيفة الحركة هي قراءات الأساسية للالتهاب بوساطة في مأمن من الحبل الشوكي. ومع ذلك، عشرات ووزن الجسم لا تسمح لإجراء تقييم في الجسم الحي من التهاب الدماغ والتهاب العصب البصري. وهذا الأخير هو مظهر باكر ومتكررة في حوالي 2/3 من مرضى التصلب المتعدد. هنا، وتبين لنا طرق تلألؤ بيولوجي والتصوير الحي القريب من الأشعة تحت الحمراء لتقييم EAE أثار التهاب العصب البصري، التهاب الدماغ، وحاجز الدم في الدماغ (BBB) اضطراب في الفئران الحية باستخدام المجراة نظام التصوير. والركيزة إضاءة الحيوية تفعيلها من خلال oxidases أظهر في المقام الأول التهاب العصب البصري. كانت إشارة محددة وسمحت التصور من آثار الدواء والمرض مرة الدورات، التي توازي عشرات من السريرية. النانوية الفلورسنت مضاد للفيروسات التي بقيت داخل vasculaturاستخدمت البريد لفترات طويلة من الوقت لتقييم سلامة BBB. بالقرب من الأشعة تحت الحمراء وكشف التصوير تسرب BBB في ذروة المرض. كانت إشارة أقوى حول العينين. تم استخدام الركيزة القريب من الأشعة تحت الحمراء للمصفوفة metalloproteinases لتقييم التهاب أثار EAE. تدخلت لصناعة السيارات في مضان مع إشارة، تتطلب unmixing الطيفي للالكمي. وعموما، كان التصوير تلألؤ بيولوجي طريقة موثوق بها لتقييم التهاب العصب البصري والدواء الآثار المرتبطة EAE وكان متفوقة على التقنيات القريب من الأشعة تحت الحمراء من حيث خصوصية إشارة، متانة، وسهولة القياس الكمي، والتكلفة.

Protocol

1. EAE التعريفي في SJL / J الفئران

  1. الفئران
    1. استخدام منذ 11 أسابيع الإناث SJL / J الفئران والسماح لهم روض إلى غرفة التجريبية لمدة 7 أيام. استخدام ن = 10 الفئران في المجموعة.
    2. لتقييم تأثيرات الدواء وإدارة المخدرات وهمي لمجموعة المراقبة بشكل مستمر عن طريق مياه الشرب أو عن طريق الغذاء الكريات تبدأ بعد 3 أو 5 أيام التحصين (ن = 10 لكل مجموعة). في ذروة المرض، إدارة الدواء أو وهمي مع الحليب أو 3٪ رقائق الذرة ينقع بالماء السكر.
  2. مادة التحصين
    1. استخدام عدة تحريض EAE تتكون من المستضد (الببتيد من البروتين شحم بروتيني، PLP139-151، 1 ملغ / مل مستحلب) في مستحلب مع مساعد الكامل فرويند (CFA، قتلت الحرارة المتفطرة السلية H37 رع) و 2 قارورة (5 ميكروغرام لكل منهما) من السم السعال الديكي مجفف بالتجميد (PTX).
    2. حل PTX (2 ميكروغرام / مل) في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، أي </ م> إضافة 1.5 مل من برنامج تلفزيوني على كل أنبوب PTX، وتخلط جيدا، وإزالة بنفس طرف الماصة، وإضافة إلى 1 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل)؛ اخلط جيدا.
  3. تحصين
    1. حقن حزب العمال التقدمي / CFA تحت الجلد في 2 أجزاء، كل 100 ميليلتر، سواء على قاعدة الذيل. لا حقن في الجزء الخلفي من الرقبة، لأن أي ردود فعل المناعة في الجلد في الجزء الأعلى من الظهر أو العنق ويشوش على تصوير الرأس والحبل الشوكي.
    2. ضخ 100 ميكرولتر من PTX البريتونى (الملكية الفكرية)، مرتين في الماوس، أول 1-2 ساعة بعد التطعيم، والثانية في 24 ساعة.
    3. للالسيطرة على الفئران، وضخ CFA من دون حزب العمال التقدمي (2 أجزاء من 100 ميكرولتر)، بالإضافة إلى PTX دون حزب العمال التقدمي.
  4. التعامل مع الماوس بعد التطعيم
    1. وزن الفئران كل يوم حتى آخر ليوم 7، ثم وزن لهم يوميا.
      ملاحظة: الفئران تفقد حوالي 1 - 2 غرام من وزن الجسم خلال EAE. يمثل انخفاضا بداية EAE.
    2. تقييم الأعراض السريرية يوميا من يوم 7 الاتفاقجي لأنظمة القياسي بتسجيله (أي نقاط 0: لا تغييرات واضحة في الوظائف الحركية، يسجل 0.5: شلل البعيدة من الذيل، درجة 1: شلل ذيل الكامل، يسجل 1.5: شلل جزئي خفيف في إحدى أو كلتا رجليه الخلفيتين، يسجل 2: شلل شديد في رجليه الخلفيتين، يسجل 2.5: الشلل التام من الساق الخلفية واحد؛ النتيجة 3: الشلل التام من ساقيه الخلفيتين، يسجل 3.5: الشلل التام من رجليه الخلفيتين وشلل جزئي من الساق الأمامية واحد الموت ببطء الفئران مع عشرات من 3.5 أو أعلى ل > 12 ساعة.
  5. EAE الدورة ووقت التصوير
    1. إجراء التصوير الأولى في بداية المرض، عندما تصل الفئران العشرات> 1، والتي سوف تحدث في جميع أنحاء يوم 10-12 بعد التحصين.
    2. إجراء التصوير الثاني في الذروة، والتي سوف يتم التوصل إلى 1 أو 2 بعد أيام من ظهور الاعراض عليهم الأولية وتستمر لمدة 1-3 أيام.
      ملاحظة: بعد ذلك، سوف الفئران يتعافى تماما في غضون 7 إلى 10 أيام. التصوير خلال فترات قد لا تزال تظهر تسرب الأوعية الدموية،لكن مؤشرات الالتهاب يجب أن تكون سلبية.

2. إضاءة الحيوية والتصوير القريبة من الأشعة تحت الحمراء من التهاب العصب البصري والمخ التهاب

  1. إعداد نظام التصوير
    1. أداء في مجال التصوير المجراة مع أي المعدات التي تسمح لتحليل تلألؤ بيولوجي وإشارات الأشعة تحت الحمراء القريبة.
    2. حافظ على الفئران تحت 2-2،5٪ الأيزوفلورين التخدير خلال جميع الإجراءات التصوير.
    3. موقف واحد أو اثنين من الفئران بجانب بعضها البعض في الجهاز باستخدام إمدادات الغاز المتوسطة. وضع العمود الفقري العلوي في المركز.
    4. استخدام اثنين من الفئران في وقت واحد، واحد في كل مجموعة، لتقييم تأثيرات الدواء للمقارنة بين الأزواج. وهذا أمر مهم للتصوير إضاءة الحيوية.
    5. حماية الموقع من التحصين مع قطعة قماش سوداء وأخذ صورة فوتوغرافية وخط الأساس لتقييم المواقع الصحيحة من الماوس / الفئران. استخدام التركيز B بمسافة 6.5 سم إلى الكاميرا لجميع الصور.
  2. الحقن والتصوير من التحقيق التهاب إضاءة الحيوية
    1. استخدام في الجسم الحي إعدادات نظام التصوير: برنامج التحصين الموسع-BLI، إم تصفية مفتوحة، مثال مرشح كتلة، fstop 1، binning 8، والتركيز B = 6.5 سم، والتعرض الإعلان 120 ق. التقاط صورة أساسية.
    2. ضخ 100 الملكية الفكرية ميكرولتر من كاشف chemiluminescent جاهزة للاستعمال (40 ملغ / مل). تخلط جيدا قبل ملء المحقن.
    3. التقاط الصور تلألؤ بيولوجي 5 و 10 و 15 دقيقة بعد الحقن. على مدار الساعة من ذروة إضاءة الحيوية التي تختلف بين الحيوانات.
      ملاحظة: سوف ذروة تحدث 5-10 دقائق بعد الحقن. انخفاض في 15 دقيقة إلى أن ليس هناك حاجة لمزيد من الصور. استخدام الماوس أزواج من مجموعات المراقبة والعلاج للقضاء على التحيز طفيفة نظرا لمختلف الدورات الوقت.
    4. شغل في وصف ذات الصلة إلى التجربة. لاحظ مربع الحوار المنبثقة تلقائيا؛ ويشمل المعلومات، مثل سلالة الماوس، الجنس، وأشر الوقت، والوقت من حقن التحقيق، مجموعة، الخ. حفظ كافة الملفات في سمجلد ني. سيكون لديهم علامات الساعة وجميع الأوصاف.
  3. الحقن والتصوير النانوية الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة لسلامة BBB
    1. استخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة التصوير epifluorescence في التركيز ب (المسافة: 6.5 سم). ماكسيما الإثارة / الانبعاثات من الجسيمات النانوية الفلورسنت مضاد للفيروسات و675/690 نانومتر. التقاط صورتين في أطوال موجية مختلفة، في Ex640 / Em700 وEx675 / Em720. استخدام ليالي 2 التعرض binning 8، وfstop 2. أخذ صورة خط الأساس.
    2. ضخ 70 ميكرولتر من النانوية الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت مضاد للفيروسات الرابع عن طريق الوريد الذيل وتخيل الفئران 3 ساعات و 24 ساعة بعد الحقن باستخدام الإعدادات أعلاه. مزيج البئر حل قبل ملء المحقن.
    3. ضخ 0.9٪ كلوريد الصوديوم في السيطرة على الفئران، والتي سوف تكون هناك حاجة لتقييم خصوصية الإشارة.
  4. الحقن والتصوير لجنة التحقيق الفلورسنت القريب من الأشعة تحت الحمراء للنشاط MMP
    1. يحلق أو يزيل الشعر من الرأس وشمنطقة العمود الفقري pper بحذر يوم واحد قبل التقاط الصورة الأساس. يجب عدم جرح الجلد.
    2. استخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة التصوير epifluorescence في التركيز ب (المسافة: 6.5 سم). ماكسيما الإثارة / انبعاث التحقيق activatable المشاركة المتناقصة و680/700 نانومتر. التقاط صورتين في أطوال موجية مختلفة، في Ex640 / Em700 وEx675 / Em720. استخدام ليالي 1 التعرض binning 8، وfstop 2. أخذ صورة خط الأساس.
    3. إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X إلى أنبوب 1.5 مل من محلول جاهزة للاستخدام (20 نانومول / 1.5 مل في برنامج تلفزيوني 1X) بحيث تكون كافية لمدة 10 الفئران. تخلط جيدا قبل ملء المحقن.
      ملاحظة: حجم المقدمة لا تأخذ في الاعتبار أن يتم فقدان بعض وحدات التخزين خلال ملء حقنة وحقن.
    4. ضخ 150 ميكرولتر من د التحقيق عن طريق الوريد الذيل 24 ساعة قبل التصوير. حقن برنامج تلفزيوني فقط في الحيوانات السيطرة لتقييم خصوصية الإشارة.
    5. في 24 ساعة بعد الحقن، والتقاط صور برنامج التحصين الموسع-FL على الأقل اثنين من الأطوال الموجية، Ex640 / Em700 والمحررين 675 / EM720، مع إعدادات موضح أعلاه (1-ق التعرض، والتركيز B، binning 8، وfstop 2).
      ملاحظة: استخدام اثنين من موجات يسمح للunmixing الأطياف بطرح إشارة غير محددة.

3. تحليل صورة

  1. تحليل تلألؤ بيولوجي (BLI)
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق البرنامج لفتحه.
    2. في شريط القوائم العلوي، انقر على أيقونة ملف المتصفح، انتقل إلى الدليل من مجلد من هذه التجربة، وتحديده. هذا سيفتح جميع الملفات في المجلد في جدول.
    3. تكوين الأعمدة التي تبين أوصاف ذات الصلة إلى التجربة.
    4. لمراقبة الجودة، انقر نقرا مزدوجا فوق ملف على فأرة الحاسوب عدم الرد من دون أعراض EAE و / أو الماوس السذاجة تحقق خصوصية إشارات EAE.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك أي إشارة في الفئران ساذجة والحد الأدنى من إشارة في الفئران غير مستجيب.
      1. التحقق من الصورة الأساسية قبل حقن للمحترفينيكون لكل فأر كما مزيد من السيطرة على خصوصية إشارة. ينبغي أن يكون سلبيا.
    5. لتحديد صورة، انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الأول من أول ماوس EAE وتحقق من شدة إضاءة الحيوية (طرفية شريط المدى) والتعريب. تحقق من كل الصور واحدة تلو الأخرى. إغلاق الملف مع أقل كثافة لكل الماوس (أي، والحفاظ على 2 من 3 صور لكل الماوس).
    6. صورة تعديل والتصدير
      1. انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الأول إلى أن يكون كميا. مراقبة نافذة البوب ​​الجديد يصل. تحت عنوان "خيارات" (القائمة العلوية)، وتخصيص تسميات لعرضه في كل صورة.
      2. في لوحة أداة الصحيح، انتقل إلى "تعديل الصور". افتراضيا، يتم تعيين كثافة الحد الأدنى والحد الأقصى ل"السيارات" وعرضها في pseudocolor قوس قزح. حدد "يدوي" إلى تغيير الإعدادات إذا لزم الأمر.
        ملاحظة: على سبيل المثال، قد يكون كل صور المصدرة الحانات طرفية متطابقة (الدنيا متطابقة وماكسيما) لتكون قابلة للمقارنة بسهولة.تعديل الحدود الدنيا والحدود القصوى ليس له أي تأثير على النتائج الكمية.
      3. انقر على تصدير صورة، حدد بابوا نيو غينيا، الدليل، واسم الصورة
    7. الكمي من المناطق ذات الاهتمام (ROI)
      1. انتقل إلى أداة "العائد على الاستثمار" في لوحة الأدوات. حدد طريقة العائد على الاستثمار (دائرة، مستطيل، والسيارات، أو خالية من ناحية) وعدد رويس. مراقبة نافذة العائد على الاستثمار يطفو على السطح في نافذة الصورة.
      2. باستخدام الماوس، وضبط حجم وموضع. استخدام عتبات العائد على الاستثمار متطابقة لجميع الصور إذا تم استخدام أداة لصناعة السيارات في العائد على الاستثمار. استخدام المناطق متطابقة لجميع الصور إذا تم تعريف أحجام العائد على الاستثمار والمواقف يدويا (على سبيل المثال، رويس التعميم).
      3. انقر على "قياس RO.I. مراقبة نافذة البوب الجديد يصل. تخصيص الأعمدة (على سبيل المثال، اسم الملف، عدد الحيوانات، مجموعة، التجربة، منطقة، العدد الكلى، متوسط التهم، تهمة SD، دقيقة والحد الأقصى تحصي، منطقة، وقت نقطة، والوقت من حقن التحقيق، وما إلى ذلك). احفظ الإعدادات المخصصة. عندما إعادةعدي، حدد كافة (السيطرة + A)، ونسخ ولصق الجدول في جدول بيانات.
      4. تصدير الصورة كما بابوا نيو غينيا مع رويس في المكان. حفظ وإغلاق ملف الصورة.
    8. كرر الإجراء (الخطوات 3.1.6 - 3.1.7) لجميع ملفات الصور التي تحتاج إلى أن يكون كميا. نسخ كافة التحديد الكمي العائد على الاستثمار في جدول البيانات.
      ملاحظة: وهنا النتائج يمكن فرزها من قبل مجموعة، نقطة زمنية، وغيرها، وتحليلها إحصائيا. استخدام العد الكلي للإشارات تلألؤ بيولوجي في رويس التحليلات الإحصائية.
  2. (الجرد) تحليل الأشعة تحت الحمراء القريب من الجسيمات النانوية الفلورسنت
    1. باستخدام عناصر التحكم في البرنامج، وضبط عتبة الصورة.
      ملاحظة: هذا ليس له أي تأثير على النتيجة الكمية.
    2. بصريا مقارنة الصور التي تم التقاطها في السابق / إم 675/720 والمحررين / إم 640/700 لتقييم خصوصية الإشارة.
    3. استخدام الصور التي تم التقاطها في السابق / إم 675/720 للتحليل الكمي (الإثارة القصوى: 680 نانومتر). تحديد رويس، والتي يمكن أن تستخدم أداة لصناعة السيارات في العائد على الاستثمار. ضبط عتبة لصناعة السيارات في العائد على الاستثمار واستخدامه لجميع الصور. قياس كفاءة مشع الإجمالية في رويس (راجع الخطوة 3.1).
  3. (الجرد) تحليل الأشعة تحت الحمراء القريب من التحقيق الحساسة البروتيني
    1. باستخدام ضوابط البرنامج، وضبط عتبة الصورة.
      ملاحظة: هذا ليس له أي تأثير على النتيجة الكمية. أداء unmixing الطيفي لصناعة السيارات في مضان. ويتم تنفيذ الأداة unmixing في صورة حية. يستخدم-unmixing السيارات في السابق / إم 640/700 كما محدد، و675/720 كصورة السيارات الفلورسنت.
    2. حدد الصورة غير مخلوطة وتحديد رويس، كما هو موضح أعلاه. استخدام كفاءة مشع الإجمالية في رويس لالتحليلات الكمية والإحصائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

دورة الوقت من ضوء بارد من التهاب العصب البصري

كانت إشارة تلألؤ بيولوجي لجنة التحقيق التهاب الأقوى حول العينين ويحدث بشكل حصري في الفئران EAE مع التهاب العصب البصري. حدثت إشارة في أي من الفئران غير EAE-ولا الفئران لا حقن مع لجنة التحقيق التهاب. اختفت إشارة عندما تعافى الفئران. وبالتالي، فإن الإشارة محددة لالتهاب العصب البصري، وذروة إشارة يوازي ذروة درجات EAE السريرية. ويبين الشكل 1 مثالين من الفئران SJL / J تصويرها في يوم 10 و 14 بعد EAE الاستقراء. وكانت إشارة للإضاءة الحيوية أعلى في يوم 10 و اختفت عندما بدأت الفئران لاسترداد. الدورات الوقت من علامات سريرية الملائمة اختفاء إشارة للإضاءة الحيوية (على سبيل المثال-1) أو سبق (على سبيل المثال-2) انخفاض درجات.

ف together.within الصفحات = "1"> شكل 1
الشكل 1. دورة الوقت من التهاب العصب البصري وعشرات السريرية في الفئران EAS-SJL / J. تم التقاط الصور للإضاءة الحيوية من التهاب العصب البصري 10 دقيقة بعد حقن التهاب التحقيق (100 الملكية الفكرية ميكرولتر) خلال الواحد ومضيئة 1 من المرض في اثنين من SJL / الفئران J في نقاط زمنية مختلفة بعد التحصين. تم القبض على الصور للإضاءة الحيوية (اللوحة اليسرى) بعد 10 و 14 يوما التحصين وتعرض كتراكبات صورة قوس قزح pseudocolor. وتتراوح الحانات لوط من اللون الأزرق (المنخفضة) إلى الأحمر (عالية تلألؤ بيولوجي). شريط مقياس: 1 سم. وتظهر اللوحة اليمنى شريط الرسوم البيانية من إجمالي تعداد تلألؤ بيولوجي الفردية في رويس (يعني ± التنمية المستدامة من 3 صور لكل منهما) ودوام من عشرات EAE السريرية. السهام الحمراء بمناسبة أيام التصوير. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر هاءrsion من هذا الرقم.

تقييم العلاج فعالية

التهاب التحقيق

وتظهر آثار الدواء (R-فلوربيبروفين 5 ملغ / كغ / د) 5 في الشكل 2. يتم عرض خمسة أمثلة من الصور للإضاءة الحيوية في كل مجموعة. وكانت عشرات في مجموعة مركبة والعلاج غير متجانسة، ولكن في كل الفئران، وكانت إشارة للإضاءة الحيوية في العين تظهر التهاب في العصب البصري أقل في مجموعة الدواء (الشكل 2A). الكمي لمجموع التهم إضاءة الحيوية في رويس أكد العلاج كبيرة فعالية (الشكل 2B، مع قطع مربع من إجمالي تعداد للإضاءة الحيوية، أونبايريد 2 الذيل اختبار t، P <0.05). اتفقت نتائج التصوير مع تأثير علاجيالصورة من الدواء من حيث علامات سريرية ومظاهره النسيجية من EAE في الحبل الشوكي والعصب البصري 5.

الشكل 2
الشكل 2. فعالية من الأدوية في الفئران EAE-SJL / J باستخدام التصوير Bioluminescent. تلقت SJL / J الفئران السيارة أو دواء (R-فلوربيبروفين 5 ملغ / كغ / د) من يوم 5 بعد التحصين. تم القبض على الصور بعد الحقن لجنة التحقيق التهاب (100 ميكرولتر الملكية الفكرية) في 1 شارع EAE الذروة، ن = 10 لكل مجموعة. EAE المتقدمة في 10/7 في كلا المجموعتين، وكانت EAE غير المستجيبين من دون إشارة. أ) ألقت القبض على الصور تلألؤ بيولوجي في الفئران التي تعيش 5-15 دقيقة بعد حقن الملكية الفكرية من 100 ميكرولتر من التحقيق التهاب يتم عرض كتراكبات صورة قوس قزح pseudocolor. وتتراوح الحانات طرفية من اللون الأزرق (المنخفضة) لالحمراء (عالية الكثافة). شريط مقياس: 1 سم. ذروة الفرديةمن إجمالي تعداد للإضاءة الحيوية في رويس كانت تستخدم لتقدير. اقتصرت رويس في الرأس. وقد حجبت مواقع الحقن حزب العمال التقدمي مع قطعة قماش سوداء. B) المؤامرات صندوق تبين الكمي من إجمالي تعداد في رويس. يمثل مربع مجموعة الشرائح الربعية، والخط هو متوسط، وتظهر شعيرات الحد الأدنى إلى الحد الأقصى. اختلف العدد الكلى بشكل ملحوظ بين المجموعات (2 من جانب وأونبايريد اختبار t، P <0.05)، مما يدل على الحد من التهاب العصب البصري والتهاب الدماغ لدى الفئران من العلاج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النانوية الفلورسنت مضاد للفيروسات

وكشفت الصور Epifluorescence النانوية الأشعة تحت الحمراء القريبة تسرب الأوعية الدموية حول العينين والدماغ في كلا جروب العلاجملاحظة (الشكل 3A، 2 أمثلة). الجسيمات توزيع ببطء شديد من الدم إلى الفضاء الخلالي، باستثناء المواقع من الالتهاب، حيث يتراكم الصبغة، مما يسمح لتقييم سلامة BBB. وكان تسرب واضح في 3 ساعات و 24 ساعة بعد الحقن من الجسيمات النانوية، ولكنه كان أقوى في نقطة زمنية لاحقة. لم يكن هناك أي إشارة محددة في الفئران غير EAE أو الفئران لا حقن مع النانوية (اللوحة اليمنى). ومن هنا، كانت إشارة محددة. لم التحليل الكمي للكفاءة مشع في رويس (الشكل 3B) لم تكشف عن فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات العلاج (ن = 3 لكل مجموعة، أونبايريد 2 الذيل اختبار t، P <0.05).

الشكل (3)
الشكل 3. تقييم انقطاع الدم الدماغ الحاجز مع مضاد للفيروسات نيون النانوية. تلقى الفئران SJL / J السيارة أو دواء (R-flurbiprofأون 5 ملغ / كغ / د) من يوم 5 بعد التحصين. تم التقاط الصور 3 ساعات و 24 ساعة بعد الحقن النانوية بالقرب من الأشعة تحت الحمراء التي تحمل علامات (70 ميكرولتر الرابع) خلال ذروة 1 EAE، ن = 3 لكل مجموعة. كانت EAE غير المستجيبين من دون إشارة. تم استخدام أداة لصناعة السيارات في العائد على الاستثمار لتقدير كفاءة مشع. اقتصرت على رويس في الرأس. وقد حجبت مواقع الحقن حزب العمال التقدمي. أ) صور epifluorescence المثالية من الفئران الحية، القبض على 3 ساعات و 24 ساعة بعد الحقن النانوية. واستخدمت صور من الفئران دون EAE أو بدون حقن النانوية والضوابط التصوير. شريط مقياس: 1 سم. وتتراوح الحانات طرفية من الأحمر الداكن (المنخفضة) إلى الأصفر (عالية الكثافة). ب) الرسوم البيانية شريط يبين تقدير كفاءة مشع في رويس (يعني ± SD). لم مجموعات العلاج لا تختلف كثيرا (2 من جانب وأونبايريد اختبار t). الرجاء النقر هنا لضد iew نسخة أكبر من هذا الرقم.

مصفوفة الفلزي تراعي التحقيق

بعد طرح لصناعة السيارات في مضان، وكشفت الصور من التحقيق MMP-البروتيني activatable التهاب في الدماغ والنخاع الشوكي في الفئران EAE (الشكل 4A، أمثلة من 4 الفئران في كل مجموعة). لم يكن هناك أي إشارة في الفئران لا حقن مع لجنة التحقيق، ووقع إشارة ضعيفة في الماوس EAE دون أعراض سريرية (غير المستجيب). تظهر الصور في الشكل (4) إشارة في السابق / إم 640/700 تطرح من قبل صورة في السابق / إم 675/720. تم الكشف عن الفروق بين المعاملات إلا بعد التحليل الكمي للكفاءة مشع في السيارات رويس بعد unmixing الطيفي (الشكل 4B، أونبايريد 2 الذيل اختبار t، ن = 6 و 4 P <0.05).

ديزيل / ftp_upload / 55321 / 55321fig4.jpg "/>
الشكل 4. تقييم آخر الفلزي مع التحقيق التصوير MMP تراعي القريب من الأشعة تحت الحمراء. تلقت SJL / J الفئران السيارة أو دواء (R-فلوربيبروفين 5 ملغ / كغ / د) من يوم 5 بعد التحصين. تم التقاط الصور بعد 24 ساعة من الحقن لجنة التحقيق (150 ميكرولتر الرابع) في ذروة EAE 1ST، ن = تم محمية 6 و 4. مواقع الحقن حزب العمال التقدمي. واستخدمت EAE غير المستجيبين والفئران بدون حقن تحقيق المشاركة المتناقصة والضوابط. تم القبض على كل صور 2 في السابق / إم 640/700 نانومتر (إشارة محددة) و675/720 نانومتر (لصناعة السيارات في مضان). باستخدام أداة unmixing الطيفية، وكان طرح في مضان السيارات، وبعد ذلك، تم استخدام أداة لصناعة السيارات في العائد على الاستثمار لتحديد مواقع النشاط MMP محددة. تم استخدام الكفاءة الكلية مشع لتقدير. أ) اعتقلت صور epifluorescence المثالية في الفئران التي تعيش 24 ساعة بعد الحقن التحقيق. الصور هي نتيجة unmixing الطيفي (UMX). شريط مقياس: 1 سم. شريط طرفيةالصورة مجموعة من الأحمر الداكن (المنخفضة) إلى الأصفر (عالية الكثافة). B) المؤامرات صندوق تبين الكمي من مجموع كفاءة مشع في رويس. يمثل مربع مجموعة الشرائح الربعية، والخط هو متوسط، وتظهر شعيرات الحد الأدنى إلى الحد الأقصى. وتشير النجمة فرق كبير بين مجموعات (2 من جانب وأونبايريد اختبار t، P <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويظهر شريط الفيديو الحالي تقنيات تلألؤ بيولوجي ومضان الأشعة تحت الحمراء القريبة في التصوير المجراة من EAE في الفئران SJL / J. وتبين لنا أن تلألؤ بيولوجي التصوير باستخدام مسبار الحساسة للالتهاب يظهر أساسا التهاب العصب البصري، ويوافق على القياس الكمي مع التقييم السريري للEAE شدة وآثار الدواء. ومع ذلك، فإن طريقة التصوير تلألؤ بيولوجي غير قادرة على الكشف عن التهاب النخاع الشوكي القطني، وهو الموقع الرئيسي للEAE مظهر 17، على الأرجح لأنه يمتص في إشارة من العمود الفقري.

التصوير القريب من الأشعة تحت الحمراء هو أكثر حساسية، ولكن على حساب من التدخل عالية مع لصناعة السيارات في مضان، الذي لا يحدث مع تلألؤ بيولوجي. الوقت تعرض الجرد الوطني هو أقصر بكثير (1-2 ق) بالمقارنة مع BLI (2-5 دقيقة)، الأمر الذي يجعل الجرد الوطني الأسلوب المفضل لسلسلة زمنية مع التغير السريع شدة إشارة.

خطوات حاسمة معفي البروتوكول، والقيود المفروضة على تقنية

إشارات من الموقع التحصين تتداخل مع التصوير الحبل الشوكي في EAE، ولكن هذا يمكن التحايل من خلال تحديد موقع كل من مواقع الحقن في قاعدة الذيل، الذي لم يكن أقل شأنا من مواقع الحقن الموصى بها (الرقبة وقاعدة الذيل). ومع ذلك، فمن الضروري لحماية مواقع حقن مع قطعة قماش سوداء.

للتصوير تلألؤ بيولوجي، لا بد من التقاط سلسلة زمنية من الصور، لأن حركية تختلف بين الحيوانات. لتجنب التحيز الناجم عن حركية، والتصوير من أزواج من السيطرة (على سبيل المثال، سيارة أو النوع البري) وعقدي (على سبيل المثال، المخدرات أو المعدلة وراثيا) الفئران هو مفيد. وفقا لالصانع، يجب أن يكون إشارة مستقرة لمدة 30 دقيقة. ومع ذلك، في EAE، لاحظنا حركية أسرع وأكثر عابرة، مع القمم التي تحدث في 5-10 دقيقة، وانخفاض كبير في 15 دقيقة.

للتصوير الأشعة تحت الحمراء القريبة، وmanufaتوصي cturer الإعداد السابق / إم لإجراء تحقيق معين. ومع ذلك، فإنه من المفيد إجراء سلسلة مرشح في البداية ولالتقاط الصور دائما على الأقل اثنين من مجموعات الإثارة / الانبعاثات، والتي تتطابق عن كثب ذكرت سابقا / إم ماكسيما، ويمكن أن تستخدم لاحقا لunmixing الطيفي للإشارات غير محددة.

ومن المهم استخدام الفئران البيضاء، مثل SJL / ياء، لأن الضوء ومضان يتم امتصاصها للغاية من الفرو الاسود. لا بد من حلق بحذر على الرأس والظهر يوم واحد قبل التصوير الفئران السوداء. ويجب تجنب آفات الجلد، لأنها سوف تظهر على شكل بقع التهابات وتتداخل مع تصوير الدماغ أو النخاع الشوكي. للتصوير الجرد الوطني، يوصي مصنع في إزالة الشعر من جميع الفئران، حتى الفئران البيضاء. حتى بعد الحلاقة، وكانت النتائج الرأس والظهر في الفئران السوداء أقل إقناعا من مع الفئران البيضاء (لا يظهر). لنموذج EAE الأساسي التقدمية في الفئران C57BL6 والفئران C57BL6 البيضاء، وهي متوافرة تجاريا، قد يكون مذبحمحلي. أصلع، مناعيا الفئران SKH1 مفيدة للتصوير الأشعة تحت الحمراء القريبة، ولكن ليس EAE، لأن هذه الفئران لديها خلفية وراثية البيضاء ولا يعتمد عليه تتطور EAE (بحد أقصى درجة: 0.5 - 1). التصوير إضاءة الحيوية باستخدام مسبار التهاب في هذه الفئران كشفت العديد من المواقع التهابات في الجلد (لا يظهر) حيث خسر بصيلات الشعر.

الجرد الوطني التصوير من نشاط الأنزيم البروتيني كشف الدماغ والتهاب النخاع الشوكي، ولكن تم فرضه من قبل إشارات لصناعة السيارات في مضان، والتي تتطلب unmixing الطيفي قبل التحليل الكمي. ومن هنا، كان الجرد الوطني التصوير أقل قوة من التصوير تلألؤ بيولوجي وكان أكثر تكلفة. ومع ذلك، قد يكون استخدام تحقيقات activatable البروتيني مفيدة لتقييم الأدوية التي تستهدف على وجه التحديد مصفوفة metalloproteinases.

المميزات والعيوب

تقنيات التصوير المختلفة هي مجانية وتتناول أسئلة محددة. مزايا bioluminالتصوير escent والقدرة على تحمل التكاليف (حوالي 20 يورو / الماوس)؛ عدم وجود صناعة السيارات في تلألؤ بيولوجي، التي من شأنها أن تتداخل مع الإشارة. خصوصية عالية. حقن الملكية الفكرية مريحة وتحليل الصور. والمتانة والموثوقية. العيوب هي التعرض مرات وامتصاص إشارة فترة طويلة الفرو الاسود والعظام.

مزايا قوائم الجرد الوطنية هي توفر أوسع من تحقيقات المسمى الجرد الوطني، وسهولة مخصصة الجرد الوطني وضع العلامات، ووقت التعرض القصير، وحساسية عالية. العيوب هي تكاليف عالية (50-100 يورو / الماوس)، امتصاص الفراء، تدخل قوي مع لصناعة السيارات في مضان، وضرورة unmixing الطيفي ومعالجة الصور قبل التحليل.

تتوفر التي تكشف عن مواقع الالتهاب لأنهم تفعيلها من خلال الأنزيمات الموالية للالتهابات التي upregulated في مواقع الالتهاب (على سبيل المثال، مستخلصات أو metalloproteinases) بسبب تسلل الخلايا المناعية عدد من التحقيقات. وبعض هذه التحقيقات أيضا الكشف عن canceالتمرير يدل تسلل الخلايا المناعية في المكروية ورم أو الافراج عن الانزيمات من الورم نفسه (على سبيل المثال، تقوم ال MMPs). سوف تحقيقات التي تتراكم في الأنسجة نتيجة لتسرب الشعرية كشف عن اضطرابات في BBB، ولكن أيضا في مواقع أخرى من الالتهابات والسرطان.

أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة

وكان مزيج من "التصوير بالإضافة إلى القروح السريرية" يتفوق على "عشرات فقط" لتقييم وضع المرض والكشف عن آثار الدواء. وافق إشارة تلألؤ بيولوجي حول العينين أيضا مع دراسة الأنسجة السابقة تبين تدمير المايلين وتتسرب الخلايا المناعية في العصب البصري 5. حوالي 2/3 من مرضى التصلب المتعدد تطوير حلقات التهاب العصب البصري. حتى الآن، لا توجد وسائل موثوق بها وغير الغازية لتحديد التهاب العصب البصري في الفئران باستثناء التصوير نشر بالرنين المغناطيسي (MRI) والمرجع الحيةtical تماسك التصوير المقطعي (أكتوبر)، والتي تطالب من الناحية الفنية 18. وقد أدخلت أكتوبر إلى EAE كوسيلة يبين التغيرات في الشبكية وضمور خلال EAE، مما يشير إلى رد فعل المناعة الذاتية في العصب البصري 19.

بالمقارنة مع الطريقة الموضحة في هذه المخطوطة، أكتوبر هو الإجهاد العالي للفئران، لأنه يتطلب التخدير العميق. قراءات ليست رؤية مباشرة للعصب البصري 19.

كان التصوير الأشعة تحت الحمراء القريبة من الجسيمات النانوية الفلورسنت مفيد لتصور تعطل BBB، وهو سمة مميزة أخرى من EAE وMS. وإلى جانب التصوير بالرنين المغناطيسي 20، 21، لا توجد طريقة غير الغازية لرصد المجراة من سلامة BBB. وهذا من شأنه أن يكون مفيدا للغاية، وذلك لأن الأدوية التجريبية والنباتية أدوية تعمل على وجه التحديد من خلال تشديد حاجز 22، 23، وهو ما يعوق عادة تجنيد الخلايا اللمفاوية المفرط في الجهاز العصبي المركزي (24). منع التعلق الكريات البيض أو التهجير من خلال BBB والحد من التسرب لها هو استراتيجية فعالة في علاج مرض التصلب العصبي المتعدد 25، والتصوير جسيمات متناهية الصغر قد تساعد على تقييم فعالية الأدوية مرشح. وحتى الآن، والجزيئات غالية الثمن. intravital المجهري هو أسلوب آخر يستخدم لتصور BBB سلامة 26، لكنه يتطلب عادة طويلة الأمد، والتخدير العميق (على سبيل المثال، مع الكيتامين وزيلازين) بسبب حج القحف ويرفض-الصحوة إعادة الفئران، وذلك منعا يحلل دوام. ومع ذلك، يوفر intravital المجهري صور عالية الدقة في الخلوي الى مستويات التحت خلوية، وهي ليست قابلة للتحقيق مع التصوير في الجسم الحي.

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان تقنية

وباختصار، فإن الشركة المصرية للاتصالات التصويرchniques المعروضة في مساعدة الفيديو الحالية لتقييم الدورات الفردية للمرض ومراقبة آثار الدواء، والتي كانت في جزء لم تكشف من قبل عشرات السريرية وحدها. يتفق التقنيات مع مبادئ 3 "R" لاستبدال، للحد من وصقل في التجارب على الحيوانات ومفيدة إضافة على الأدوات في مجال البحوث المخدرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل جمعية الألمانية للبحوث (CRC1039 A3) وبرنامج تمويل البحوث "Landesoffensive زور ENTWICKLUNG wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) في ولاية هيسن، مركز بحوث الطب بالحركة والصيدلة TMP وعدا كورون سهم Fresenius مؤسسة (EKFS)، مجموعة بحوث التدريب بالحركة البحوث الاكتشافات - فارما (رحلة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AngioSpark-680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10149 Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10126 Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA 760535 Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion  Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
Pertussis Toxin Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software  Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA CLS136334 IVIS analysis software
Isoflurane Abbott Labs, Illinois, USA 26675-46-7 Anaesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Dunn, J. Impact of mobility impairment on the burden of caregiving in individuals with multiple sclerosis. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 10 (4), 433-440 (2010).
  3. Dutta, R., Trapp, B. D. Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis. Prog Neurobiol. 93 (1), 1-12 (2011).
  4. Sawcer, S., et al. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nature. 476 (7359), 214-219 (2011).
  5. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6 (11), 1398-1422 (2014).
  6. Balls, M. The origins and early days of the Three Rs concept. Altern Lab Anim. 37 (3), 255-265 (2009).
  7. Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
  8. Leahy, A. A., et al. Analysis of the trajectory of osteoarthritis development in a mouse model by serial near-infrared fluorescence imaging of matrix metalloproteinase activities. Arthritis Rheumatol. 67 (2), 442-453 (2015).
  9. Scales, H. E., et al. Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging. Rheumatology (Oxford). 55 (3), 564-572 (2016).
  10. Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circ Res. 100 (8), 1218-1225 (2007).
  11. Eaton, V. L., et al. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. J Neuroinflammation. 10, (2013).
  12. Kandagaddala, L. D., Kang, M. J., Chung, B. C., Patterson, T. A., Kwon, O. S. Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Exp Toxicol Pathol. 64 (1-2), 109-114 (2012).
  13. Wang, C., et al. In situ fluorescence imaging of myelination. J Histochem Cytochem. 58 (7), 611-621 (2010).
  14. Wang, C., et al. Longitudinal near-infrared imaging of myelination. J Neurosci. 31 (7), 2382-2390 (2011).
  15. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm. 113 (4), 477-485 (2006).
  16. Badawi, A. H., et al. Suppression of EAE and prevention of blood-brain barrier breakdown after vaccination with novel bifunctional peptide inhibitor. Neuropharmacology. 62 (4), 1874-1881 (2012).
  17. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  18. Lin, T. H., et al. Diffusion fMRI detects white-matter dysfunction in mice with acute optic neuritis. Neurobiol Dis. 67, 1-8 (2014).
  19. Knier, B., et al. Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 56, 34-44 (2015).
  20. Schellenberg, A. E., Buist, R., Yong, V. W., Del Bigio, M. R., Peeling, J. Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Magn Reson Med. 58 (2), 298-305 (2007).
  21. Mori, Y., et al. Early pathological alterations of lower lumbar cords detected by ultrahigh-field MRI in a mouse multiple sclerosis model. Int Immunol. 26 (2), 93-101 (2014).
  22. Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nat Med. 19 (9), 1161-1165 (2013).
  23. Theien, B. E., et al. Differential effects of treatment with a small-molecule VLA-4 antagonist before and after onset of relapsing EAE. Blood. 102 (13), 4464-4471 (2003).
  24. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  25. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. J Immunol. 182 (10), 5909-5913 (2009).
  26. Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS One. 7 (12), e50915 (2012).
  27. Bukilica, M., et al. Stress-induced suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the rat. Int J Neurosci. 59 (1-3), 167-175 (1991).

Tags

الطب، العدد 121، التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي، والتصلب المتعدد، والتهاب العصب البصري، والتصوير الحي البصري، تلألؤ بيولوجي، الأشعة تحت الحمراء، التهاب
تلألؤ بيولوجي والقريبة من تحت الحمراء التصوير من التهاب العصب البصري والمخ التهاب في نموذج EAE من مرض التصلب العصبي المتعدد في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmitz, K., Tegeder, I.… More

Schmitz, K., Tegeder, I. Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (121), e55321, doi:10.3791/55321 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter