Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bioluminesens og nær-infrarøde Imaging av optikusnevritt og hjernebetennelse i EAE Modell av multippel sklerose i Mus

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55321
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Summary

Vi viser en teknikk for in vivo levende bioluminescens og nær-infrarød avbildning av optisk nevritt og hjernebetennelse i eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) modell for multippel sklerose i SJL / J-mus.

Abstract

Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) i SJL / J mus er en modell for relapsing-remitting multippel sklerose (RRMS). Kliniske EAE score beskriver motoriske funksjons underskudd er grunnleggende avlesninger av immunmediert betennelse i ryggmargen. Men, score og kroppsvekt ikke tillate for en in vivo vurdering av hjernebetennelse og optikusnevritt. Det sistnevnte er et tidlig og hyppig manifestasjon i omtrent 2/3 av MS-pasienter. Her viser vi metoder for bioluminescens og nær-infrarøde levende avbildning for å vurdere EAE fremkalt optisk nevritt, hjernebetennelse, og blod-hjerne-barrieren (BBB) avbrudd i levende mus ved bruk av en in vivo bildedannende system. En selvlysende substrat aktiveres ved oksidase viste primært optikusnevritt. Signalet var bestemt og tillot visualisering av medisiner effekter og sykdoms tid kurs, som parallelt de kliniske score. Pegylerte fluorescerende nanopartikler som forble i vasculature over lengre tid ble brukt for å vurdere BBB integritet. Nær-infrarød avbildning avslørte en BBB lekkasje ved toppen av sykdommen. Signalet var den sterkeste rundt øynene. En nær-infrarødt substrat for matriksmetalloproteinaser ble brukt for å vurdere EAE-fremkalt betennelse. Auto-fluorescens forstyrret signalet, som krever spektral unmixing for kvantifisering. Totalt sett, bioluminesens bilde var en pålitelig metode for å vurdere EAE-forbundet optikusnevritt og medisiner effekter og var overlegne i forhold til nær-infrarøde teknikker i form av signal spesifisitet, robusthet, enkel kvantifisering og kostnad.

Protocol

1. EAE Induksjon i SJL / J Mus

  1. mus
    1. Bruk 11-ukers gamle kvinnelige SJL / J mus og tillate dem å tilvenne til den eksperimentelle plass til ca 7 dager. Bruk n = 10 mus per gruppe.
    2. For vurdering av medisiner effekter, administrere medikament og placebo for kontrollgruppen kontinuerlig via drikkevann eller via mat pellets starter 3 eller 5 dager etter immunisering (n = 10 per gruppe). Under peak av sykdommen, administrere medisiner eller placebo med melk eller 3% sukker vann-gjennomvåt Cornflakes.
  2. immunisering materiale
    1. Bruke en EAE induksjon sett bestående av antigen (peptid av proteolipidprotein, PLP139-151, 1 mg / ml emulsjon) i en emulsjon med komplett Freunds adjuvans (CFA, varme-drepte Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) og 2 hetteglass (5 ug hver) av frysetørket pertussis toksin (PTX).
    2. Oppløs PTX (2 ug / ml) i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS; dvs. </ Em> legge 1,5 ml PBS til hver PTX rør, bland godt, ta med det samme pipettespiss, og legge til 1 ml PBS i en 50-ml tube); Bland godt.
  3. immunisering
    1. Injiser PLP / CFA subkutant i 2 deler, hver 100 ul, både ved haleroten. Ikke injiser inn på baksiden av halsen, fordi noen immunreaksjoner i huden i øvre rygg eller nakke vil forstyrre avbildning av hodet og ryggmargen.
    2. Injisere 100 ul PTX intraperitonealt (ip), to ganger pr mus, den første 1 - 2 timer etter immunisering og den andre i 24 timer.
    3. For kontrollmusene, injisere CFA uten PLP (2 porsjoner 100 mL) pluss PTX uten PLP.
  4. Mus håndtering etter immunisering
    1. Vei musene annenhver dag opp til dag 7, og deretter veie dem daglig.
      MERK: Mus miste ca 1-2 g kroppsvekt i løpet av EAE. Nedgangen markerer starten på EAE.
    2. Vurdere kliniske symptomer daglig fra dag 7 according til standard scoring systemer (dvs. Karakter 0: ingen åpenbare endringer i motoriske funksjoner, scorer 0,5: distal lammelse av halen, scorer 1: komplett hale lammelse, scorer 1,5: mild pareser av en eller begge bakbena, scorer to: alvorlig pareser av bakbena, scorer 2,5: fullstendig lammelse av en bakben, scorer 3: fullstendig lammelse av begge bakbena, scorer 3,5. fullstendig lammelse av bakbena og pareser av det ene forbeinet Avlive mus med score på 3.5 eller høyere for > 12 t.
  5. EAE kurs og tid for bildebehandling
    1. Utføre den første bildedannende ved utbruddet av sykdommen, når musene nå Stillingen> 1, noe som vil oppstå rundt dag 10 - 12 etter immunisering.
    2. Utføre den andre avbildning på toppen, som vil bli nådd 1 eller 2 dager etter at de første symptomene utvikle og vil vare i 1 - 3 dager.
      MERK: Deretter vil musene fullt igjen innen 7 til 10 dager. Imaging under intervallene kan likevel vise vaskulære lekkasjer,men betennelse indikatorer bør være negativ.

2. Bioluminescent og nær-infrarøde Imaging av optikusnevritt og hjernebetennelse

  1. Oppsett av imaging system
    1. Utføre in vivo avbildning med en hvilken som helst utstyr som gjør det mulig for analyse av Bioluminescens og nær-infrarøde signaler.
    2. Hold mus i henhold til 2 - 2,5% isofluran anestesi under alle avbildningsprosedyrer.
    3. Stilling en eller to mus ved siden av hverandre i anordningen ved hjelp av de midtre gass. Plasser den øvre ryggraden i sentrum.
    4. Bruk to mus samtidig, én per gruppe, for evaluering av medisiner effekter å sammenligne parene. Dette er viktig for selvlysende avbildning.
    5. Skjerme stedet for immunisering med svart tøy og ta et bilde og baseline bilde for å vurdere riktig plassering av muse / mus. Bruk B-fokus med en 6,5 cm avstand til kameraet for alle bilder.
  2. Injeksjon og avbildning av bioluminescent betennelse probe
    1. Bruk vivo avbildning systeminnstillingene i: Epi-BLI, Em filtrere åpen, Ex filter blokk, fStop en, binning 8, fokus B = 6,5 cm, annonseeksponering 120 s; ta en baseline bilde.
    2. Injisere 100 mL ip av klar til bruk kjemiluminescerende reagens (40 mg / ml). Bland godt før du fyller sprøyten.
    3. Capture Bioluminescens bilder 5, 10 og 15 minutter etter injeksjon. Tidsforløpet av bioluminescent topp skiller mellom dyr.
      MERK: Toppen vil skje 5-10 minutter etter injeksjon; en nedgang på 15 min indikerer at ingen flere bilder er påkrevd. Bruk mus par av kontroll- og behandlingsgrupper for å eliminere mindre skjevheter som skyldes ulike tids kurs.
    4. Fyll ut beskrivelser som er relevante for forsøket. Observere en dialogboks dukker opp automatisk; den inneholder opplysninger som mus stamme, kjønn, tidspunkt, tidspunkt for sonde injeksjon, gruppe, osv. Lagre filene alt i one mappen; de vil ha tid koder og alle beskrivelser.
  3. Injeksjon og avbildning av nær-infrarøde fluorescerende nanopartikler for BBB integritet
    1. Bruk nær-infrarødt epifluorescence bildebehandling i B-fokus (avstand: 6,5 cm). Eksitasjon / emisjon maxima av pegylerte fluorescerende nanopartikler er 675/690 nm. Capture to bilder med forskjellige bølgelengder, på Ex640 / Em700 og Ex675 / Em720; bruke en 2-eksponering, binning 8, og fStop 2. Ta en baseline bilde.
    2. Injiser 70 mL av pegylerte fluorescerende infrarøde nanopartikler iv gjennom halevenen og forestill musene 3 timer og 24 timer etter injeksjon ved hjelp av innstillingene ovenfor. Bland løsningen godt før du fyller sprøyten.
    3. Injiser 0,9% natriumklorid i kontrollmusene, noe som vil være nødvendig for å vurdere spesifisiteten av signalet.
  4. Injeksjon og avbildning av nær-infrarødt fluorescerende probe for MMP aktivitet
    1. Barbere eller fjerne håret på hodet og upper ryggrad region forsiktig en dag før du tar baseline bildet. Huden må ikke skadet.
    2. Bruk nær-infrarødt epifluorescence bildebehandling i B-fokus (avstand: 6,5 cm). Eksitasjon / emisjon maksima av MMP aktiverbar sonden er 680/700 nm. Capture to bilder med forskjellige bølgelengder, på Ex640 / Em700 og Ex675 / Em720; bruke et 1-eksponering, binning 8, og fStop 2. Ta en baseline bilde.
    3. Tilsett 200 ul av 1 x PBS til 1,5 ml rør i klar-til-bruk løsning (20 nmol / 1,5 ml i 1 x PBS), slik at det vil være tilstrekkelig for 10 mus; bland godt før du fyller sprøyten.
      MERK: Den oppgitte volum tar ikke hensyn til at noen volumet er tapt under sprøyte fylling og injeksjon.
    4. Injisere 150 ul av sonden iv gjennom halevenen 24 timer før avbilding. Injiser bare PBS i kontrolldyrene for å vurdere spesifisiteten av signalet.
    5. På 24 timer etter injeksjon, ta Epi-FL bilder ved minst to bølgelengder, Ex640 / Em700 og Ex 675 / EM720, med innstillingene forklart ovenfor (1-eksponering, fokus B, binning 8, og fStop 2).
      MERK: Bruk av to bølgelengder gir mulighet for spektral unmixing ved å trekke den uspesifikke signal.

3. Bildeanalyse

  1. Bioluminesens analyse (BLI)
    1. Dobbeltklikk på programvare for å åpne den.
    2. I den øvre menylinjen, klikk på ikonet filbehandler, gå til katalogen av mappen av forsøket, og velg det, Dette vil åpne alle filene i mappen i en tabell.
    3. Konfigurere kolonnene viser beskrivelsene er relevante for eksperimentet.
    4. For kvalitetskontroll, dobbeltklikker på en fil av en ikke-responder mus uten symptomer på EAE og / eller en naiv mus for å kontrollere spesifisitet av EAE signaler.
      MERK: Det skal ikke være noe signal i naive mus og minimal signal i ikke-responder mus.
      1. Sjekk referansebildet før injeksjonen av provære for hver mus som ytterligere kontroll for spesifisiteten av signalet; det skal være negativ.
    5. For å velge et bilde, dobbeltklikker du på den første filen i første EAE mus og kontroller bioluminescent intensitet (LUT bar område) og lokalisering. Sjekk alle bildene en etter en. Lukk filen med lavest intensitet for hver mus (dvs. holde to av tre bilder for hver mus).
    6. Bildejustering og utførsel
      1. Dobbeltklikk den første filen som skal kvantifiseres. Observere et nytt vindu dukker opp. Under "alternativer" (øverste menyen), tilpasse etikettene som skal vises i hvert bilde.
      2. I høyre verktøypaletten, gå til "bildejustering." Som standard er minimum og maksimum intensitet satt til "auto" og vises i regnbue pseudocolor. Velg "manuell" for å endre innstillingene om nødvendig.
        MERK: For eksempel kan alle eksporterte bildene har identisk LUT barer (identisk este og lengste) å være lett sammenlignbare.Justeringen av minima og maksima har ingen innvirkning på de kvantitative resultatene.
      3. Klikk på bildet for eksport, velger png, katalogen, og en bildenavn
    7. Kvantifisering av regioner av interesse (ROI)
      1. Gå til "ROI" verktøy i verktøypaletten. Velg ROI-metoden (sirkel, rektangulær, auto, eller fri-hånd) og antall Rois. Observer ROI vindu dukker opp i bildevinduet.
      2. Ved hjelp av musen, justere størrelse og posisjon. Bruk identiske ROI terskler for alle bildene hvis auto-ROI verktøyet brukes. Bruk identiske områder for alle bildene hvis ROI størrelser og posisjoner er definert manuelt (f.eks sirkel Rois).
      3. Klikk på "måle RO.I. Observer et nytt vindu dukker opp. Tilpass kolonnene (f.eks filnavn, dyr nummer, gruppe, eksperimentere, areal, totaltellinger, gjennomsnittlig tellinger, SD teller, min og maks teller, område, tid punkt, tidspunkt for sonde injeksjon, etc.). Lagre tilpassede innstillinger. Når reAdy, velg alle (Ctrl + A), og kopiere og lime inn tabellen i et regneark.
      4. Eksporter bildet som en png med Rois på plass. Lagre og lukk bildefilen.
    8. Gjenta prosedyren (trinn 3.1.6 - 3.1.7) for alle bildefiler som må tallfestes. Kopier alle ROI quantifications inn i regnearket.
      MERK: Her kan resultatene bli sortert etter gruppe, tidspunkt, etc. og statistisk analysert. Bruk de totale tellinger av Bioluminescens signaler i ROIs for statistiske analyser.
  2. Nær-infrarød (NIR) analyse av fluorescerende nanopartikler
    1. Ved hjelp av kontrollene i programvaren, justere terskelen av bildet.
      MERK: Dette har ingen innvirkning på kvantitative resultat.
    2. Visuelt sammenligne bilder tatt på Ex / Em 675/720 og Ex / Em 640/700 for å vurdere spesifisiteten av signalet.
    3. Bruk bilder tatt på Ex / Em 675/720 for kvantitativ analyse (eksitasjon maksimum: 680 nm). Definer ROIs, som automatisk ROI-verktøy kan brukes. Juster automatisk ROI terskel og bruke den for alle bilder. Kvantifisere den totale strålende effektivitet i ROIs (se trinn 3.1).
  3. Nær-infrarød (NIR) analyse av protease-sensitive probe
    1. Ved hjelp av programvare kontroller, justere terskelen av bildet.
      MERK: Dette har ingen innvirkning på kvantitative resultat. Utfør spektral unmixing av auto-fluorescens. Den unmixing verktøyet er implementert i Levende bilde. Den automatiske unmixing bruker Ex / Em 640/700 som spesifikke og 675/720 som auto-fluorescerende bilde.
    2. Velge den ublandede bilde og definere ROIs, som beskrevet ovenfor. Bruk den totale strålende effektivitet i Rois for kvantitative og statistiske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidsforløpet for Bioluminesens av optikusnevritt

Bioluminescence signal av betennelsen sonden var den sterkeste rundt øynene og skjedde utelukkende i EAE mus med optikusnevritt. Et signal oppstod i verken de ikke-EAE mus eller mus ikke injisert med betennelse sonde. Signalet forsvant da musene gjenvunnet. Derfor er signalet spesifikt for optisk nevritt, og toppen av det signal som er en parallell til toppen av de kliniske poengsummer EAE. Figur 1 viser to eksempler på SJL / J-mus avbildes på dag 10 og 14 etter EAE induksjon. Bioluminescent signal var den høyeste på dag 10 og forsvant når musene begynte å komme. Tids kurs av de kliniske score matchet forsvinningen av bioluminescent signal (eksempel-1) eller foran (eksempel-2) nedgangen i resultatet.


Figur 1. Tid Løpet av optikusnevritt og kliniske Poeng i EAS-SJL / J mus. Bioluminescerende bilder av optisk nevritt ble tatt 10 minutter etter injeksjonen av inflammasjon sonden (100 ul ip) i løpet av 1 m oppblussing av sykdommen i to SJL / J-mus ved forskjellige tidspunkter etter immunisering. Bioluminescent bilder (venstre panel) ble tatt til fange 10 og 14 dager etter immunisering og er presentert som regnbue pseudocolor fotografi overlegg. LUT barer spenner fra blå (lav) til rød (høy bioluminesens). Skala: 1 cm. Høyre panel viser søylediagrammer for de enkelte forvaltnings Bioluminescens teller i ROIs (gjennomsnitt ± SD på 3 bilder hver) og tids kurs av de kliniske EAE score. De røde pilene markerer bilde dager. Klikk her for å se et større version av dette tallet.

Vurdering av behandlingseffekt

betennelse probe

Effekten av medikamentet (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) 5 er vist i figur 2. Fem eksempler på bioluminescent bildene i hver gruppe presenteres. Poengene i bilen og behandlingsgruppen var heterogen, men i alle mus, bioluminescent signal i øyet som viser betennelse i synsnerven var lavere i medisinen gruppen (Figur 2A). Kvantifisering av de totale bioluminescent teller i ROIs bekreftet signifikant behandlingseffekt (figur 2B, med boksplott av de totale bioluminescent teller, uparet 2-tailed t-test, p <0,05). MRI-resultatene avtalt med terapeutisk effekts av medisiner i form av kliniske score og histopatologiske manifestasjoner av EAE i ryggmargen og synsnerven 5.

Figur 2
Figur 2. Effekt av medisiner i EAE-SJL / J mus ved bruk Bioluminescent Imaging. SJL / J mus fikk bilen eller medisiner (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) fra dag 5 etter immunisering. Bilder ble tatt etter injeksjon av betennelsen sonden (100 ul ip) ved en st EAE toppen, n = 10 per gruppe. EAE utviklet i 7/10 i begge grupper, og EAE ikke-respondere var uten signal. A) Bioluminesens bilder i levende mus fanget 5 - 15 minutter etter ip-injeksjon av 100 ul av betennelsen sonden er presentert som regnbue pseudocolor fotografi overlegg. LUT barer spenner fra blå (lav) til rød (høy intensitet). Skala: 1 cm. Den enkelte peakav de totale tellinger bioluminescent i ROIs ble brukt for kvantifisering. ROIs var begrenset til hodet. PLP injeksjonssteder ble skjermet med svart klut. B) Boksplott som viser kvantifisering av de totale tellinger i Rois. Boksen representerer interkvartilt område, linjen er medianen, og værhårene viser minimum til maksimum. De totale tellinger var signifikant forskjellig mellom gruppene (2-sidig uparet t-test, P <0,05), som viser en reduksjon av optisk nevritt og hjernebetennelse hos mus som fikk medisin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Pegylerte fluorescerende nanopartikler

Epifluorescence bilder av nær-infrarøde nanopartikler avslørt vaskulære lekkasjer rundt øynene og i hjernen både i behandling Groups (figur 3A, 2 eksempler). Partiklene fordele meget langsomt fra blodet til den interstitiale plass, med unntak av steder med inflammasjon, hvor fargestoffet akkumuleres, noe som muliggjør en vurdering av BBB integritet. Lekkasjen var tydelig i 3 timer og 24 timer etter injeksjonen av nanopartikler, men det var sterkere på det senere tidspunkt. Det var ingen spesifikk signal i ikke-EAE mus eller mus ikke injisert med nanopartikler (høyre panel). Derfor er signalet var spesifikk. Den kvantitative analyse av strålingseffektiviteten i ROIs (figur 3B) avslørte ikke signifikante forskjeller mellom behandlingsgrupper (n = 3 per gruppe, uparet 2-tailed t-test, P <0,05).

Figur 3
Figur 3. Vurdering av blod-hjerne barrieren avbrudd med pegylert Fluorescent Nanopartikler. SJL / J mus fikk bilen eller medisiner (R-flurbiprofno 5 mg / kg / d) fra dag 5 etter immunisering. Bilder ble tatt 3 timer og 24 timer etter injeksjonen av nær-infrarød-merkede nanopartikler (70 ul iv) i den første EAE toppen, n = 3 per gruppe. EAE ikke-respondere var uten signal. Den auto-ROI verktøy ble brukt for kvantifisering av strålingseffektiviteten. De Rois var begrenset til hodet. PLP injeksjonssteder ble skjermet. A) Eksempler på epifluorescens bilder av levende mus, tatt 3 timer og 24 timer etter injeksjon av nanopartikler. Bilder fra musene uten EAE eller uten injeksjon av nanopartikler ble anvendt som avbildnings kontroller. Skala: 1 cm. LUT barer spenner fra mørk rød (lav) til gul (høy intensitet). B) Bar diagrammer som viser kvantifiseringen av strålingseffektiviteten i ROIs (gjennomsnitt ± SD). Behandlingsgruppene var ikke signifikant forskjellig (2-sidig uparet t-test). Klikk her for å v IEW en større versjon av dette tallet.

Matriksmetalloproteinase følsom sonde

Etter subtrahering av auto-fluorescens, bilder av protease-aktiverbar MMP probe avslørte betennelse i hjernen og ryggmargen i EAE mus (figur 4A, eksempler på 4 mus per gruppe). Det var ikke noe signal i mus ikke injisert med sonden, og et svakt signal oppstod i en EAE mus uten kliniske symptomer (ikke-responder). Bilder i Figur 4 viser signalet på Ex / Em 640/700 trekkes av bildet på Ex / Em 675/720. Forskjeller mellom behandlinger ble avdekket bare etter den kvantitative analyse av strålingseffektiviteten i auto-ROIs etter spektral unmixing (figur 4B, uparet 2-tailed t-test, n = 6 og 4, P <0,05).

iles / ftp_upload / 55321 / 55321fig4.jpg "/>
Figur 4. Vurdering av Metalloproteinase aktivitet med nær-infrarødt MMP-sensitive Imaging Probe. SJL / J mus fikk bilen eller medisiner (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) fra dag 5 etter immunisering. Bilder ble tatt 24 timer etter injeksjonen av proben (150 ul iv) ved den første EAE toppen, n = 6 og 4. PLP injeksjonssteder ble skjermet. EAE ikke-respondere og musene uten MMP-probe-injeksjoner ble anvendt som kontroller. Hver 2 bildene ble tatt på Ex / Em 640/700 nm (spesifikk signal) og 675/720 nm (auto-fluorescens). Ved hjelp av den spektrale unmixing verktøyet ble auto-fluorescens trukket og senere, auto-ROI verktøyet ble brukt til å identifisere områder av spesifikke MMP aktivitet. Den totale strålingseffektiviteten ble brukt for kvantifisering. A) Eksempler epifluorescence bilder i levende mus fanget 24 timer etter probe injeksjon. Bildene er et resultat av spektral unmixing (UMX). Skala: 1 cm. LUT bars spenner fra mørk rød (lav) til gul (høy intensitet). B) Boksplott som viser kvantifisering av det totale strålende effektivitet i Rois. Boksen representerer interkvartilt område, linjen er medianen, og værhårene viser minimum til maksimum. Stjernen indikerer en signifikant forskjell mellom gruppene (2-sidig uparet t-test, p <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den foreliggende video viser teknikker for bioluminescens og nær-infrarøde fluorescens in vivo avbildning av EAE i SJL / J-mus. Vi viser at bioluminescens avbildning ved hjelp av en betennelse følsom sonde viser hovedsakelig optisk nevritt, og kvantifiseringen stemmer overens med klinisk evaluering av EAE alvorlighetsgrad og virkningene av medikamenter. Imidlertid Bioluminescens avbildningsmetoden var ikke i stand til å detektere betennelse av den lumbale ryggmargen, som er en primær område av EAE manifestasjon 17, sannsynligvis fordi signalet blir absorbert av ryggraden.

Den nær-infrarød avbildning er mer følsom, men på bekostning av høy interferens med auto-fluorescens, noe som ikke forekommer med bioluminescens. Eksponeringstiden av NIR er mye kortere (1 - 2 s) sammenlignet med BLI (2 - 5 min), noe som gjør NIR den foretrukne metode for tidsserier med raskt skiftende signalintensiteter.

Kritiske trinn medi protokollen og begrensninger av teknikken

Signaler av immunisering området forstyrrer ryggmarg avbildning i EAE, men dette kan omgås ved å plassere begge injeksjonssteder ved haleroten, som ikke var dårligere enn de anbefalte injeksjonssteder (hals og bunn av halen). Likevel er det nødvendig å skjerme injeksjonssteder med svart klut.

For bioluminesens imaging, er det viktig å fange opp en tidsserie av bilder, fordi kinetikk skiller mellom dyr. For å unngå skjevheter forårsaket av kinetikk, avbildning av par av kontroll (for eksempel bil eller villtype) og verum (f.eks, narkotika eller transgen) mus er en fordel. Ifølge produsenten, må signalet være stabil i 30 min. Men i EAE, observerte vi raskere og mer forbigående kinetikk, med topper som oppstår ved 5 - 10 min og en betydelig nedgang på 15 min.

For nær-infrarød avbildning, det manufacturer anbefaler Ex / Em innstillingene for en sonde. Likevel, det var nyttig å kjøre et filter serie utgangspunktet og å alltid ta bilder på minst to eksitasjon / utslippskombinasjoner, noe som stemmer godt overens med rapportert Ex / Em maxima og kan senere brukes for spektral unmixing av uspesifikke signaler.

Det er viktig å bruke hvite mus, som SJL / J, fordi lys og fluorescens er sterkt absorbert av svart pels. Svart mus må være forsiktig barbert på hodet og tilbake en dag før bildebehandling. Hudlesjoner må unngås, fordi de vil fremstå som provoserende flekker og forstyrre avbildning av hjernen eller ryggmargen. For NIR imaging, produsenten anbefaler hårfjerning av alle mus, hvite mus. Selv etter barbering, hodet og ryggen resulterer i svart mus var mindre overbevisende enn med hvite mus (ikke vist). For primær-progressiv EAE modellen i C57BL6 mus, kan det hvite C57BL6 mus, som er kommersielt tilgjengelige, være en alterinnfødt. Naken, immunkompetente SKH1 mus er nyttige for nær-infrarød avbildning, men ikke EAE, fordi disse musene har en albino genetisk bakgrunn og ikke pålitelig utvikler EAE (maks poengsum: 0,5 - 1). Bioluminescent avbildning ved hjelp betennelse sonde i disse musene avdekket flere inflammatoriske flekker i huden (ikke vist) hvor hårsekkene er tapt.

NIR avbildning av proteaseaktivitet avdekket hjerne og ryggmarg betennelse, men signalene ble overlagret ved auto-fluorescens, noe som krever spektral unmixing før kvantitativ analyse. Derfor NIR bilde var mindre robust enn bioluminescence bildebehandling og ble dyrere. Imidlertid kan bruk av protease aktiverbare sonder være nyttig for vurdering av medikamenter som spesifikt retter matriksmetalloproteinaser.

Fordeler og ulemper

De ulike bildeteknikker er gratis og løse konkrete spørsmål. Fordelene med bioluminescent bildebehandling er rimelig (ca 20 Euro / mus); en mangel på auto-bioluminescens, noe som ville forstyrre signalet; høy spesifisitet; praktisk ip injeksjon og bildeanalyse; og robusthet og pålitelighet. Ulemper er lange eksponeringstider og signal absorpsjon av svart pels og bein.

Fordeler med NIR er bredere tilgjengeligheten av NIR-merkede prober, brukervennlighet tilpasset NIR merking, kort eksponeringstid, og høy følsomhet. Ulempene er høye kostnader (50-100 Euro / mus), absorpsjon av pels, sterke forstyrrelser med auto-fluorescens, og nødvendigheten for spektral unmixing og bildebehandling før analyse.

En rekke av sonder, er tilgjengelig som gjenkjenner inflammasjonssteder fordi de er aktivert av proinflammatoriske enzymer som er oppregulert på steder med inflammasjon (for eksempel, peroksydaser eller metalloproteinaser) på grunn av infiltrasjon av immunceller. Noen av disse probene vil også oppdage ningrs demonstrerer immuncelleinfiltrasjon inn i svulsten mikromiljøet eller frigjøring av enzymer ved selve svulsten (f.eks MMP). Sonder som akkumuleres i vev på grunn av kapillær lekkasje vil oppdage forstyrrelser i BBB, men også på andre områder av betennelse og kreft.

Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder

Kombinasjonen av "bilde pluss kliniske sår" var bedre enn "score bare" for vurdering av sykdomsstatus og påvisning av medisinering effekter. Bioluminescence signal rundt øynene er også enig med tidligere histopatologiske studier som viser myelin ødeleggelse og immunceller infiltrerer i synsnerven 5. Om lag 2/3 av MS-pasienter utvikler episoder av optikusnevritt. Så langt er det ingen pålitelig, ikke-invasive metoder for å kvantifisere optikusnevritt i levende mus unntatt diffusjon magnetic resonance imaging (MRI) og optisk sammenheng tomografi (OCT), som er teknisk krevende 18. Oktober har blitt introdusert i EAE som en metode som viser retinale forandringer og atrofi i løpet av EAE, noe som tyder på en autoimmun reaksjon i synsnerven 19.

Sammenlignet med fremgangsmåten som er beskrevet i dette manuskriptet, er oktober en høyere stressfaktor for mus, fordi det krever dyp anestesi. Avlesning er ikke en direkte visualisering av synsnerven 19.

Nær-infrarød avbildning av fluorescerende nanopartikler var nyttig å visualisere forstyrrelse av BBB, som er et annet kjennetegn på EAE og MS. Dess MR 20, 21, er det ingen ikke-invasiv metode for in vivo overvåkning av BBB integritet. Dette ville være ganske nyttig, fordi eksperimentelle narkotika og phyto-medisiner spesifikt handle ved å stramme barrieren 22, 23, som normalt hindrer overdreven lymfocytt rekruttering inn i CNS 24. Forebygging av leukocytter vedlegg eller sjelevandring gjennom BBB og redusere sin leakiness er en effektiv strategi i MS behandling 25, og nanopartikkel bildebehandling kan bidra til å vurdere effekten av kandidat narkotika. Så langt, at partiklene er dyre. Intravital mikroskopi er en annen teknikk som brukes til å visualisere BBB integritet 26, men det krever normalt langvarige, dyp anestesi (f.eks, med ketamin og xylazin) på grunn av kraniotomi og forbyr re-oppvåkning musene, og dermed forebygge tidsforløpet analyser. Men gir intramikros høyoppløselige bilder på celle til subcellulære nivåer, som ikke er oppnåelig med in vivo imaging.

Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre teknikken

I sammendraget, bilde techniques presentert i dagens video hjelp til å vurdere de enkelte kurs av sykdommen og for å overvåke effekten av medisiner, som var delvis ikke avslørt av kliniske score alene. Teknikkene er enig med de 3 "R" prinsipper for erstatning, reduksjon og Refinement i dyreforsøk og er nyttige add-on verktøy i rusmiddelforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) og forskningsmidler programmet "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) i delstaten Hessen, Research Center for translasjonell medisin og farmakologi TMP og Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS), forskerutdanning Gruppe translasjonell forskning innovasjon - Pharma (TRIP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AngioSpark-680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10149 Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10126 Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA 760535 Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion  Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
Pertussis Toxin Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software  Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA CLS136334 IVIS analysis software
Isoflurane Abbott Labs, Illinois, USA 26675-46-7 Anaesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Dunn, J. Impact of mobility impairment on the burden of caregiving in individuals with multiple sclerosis. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 10 (4), 433-440 (2010).
  3. Dutta, R., Trapp, B. D. Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis. Prog Neurobiol. 93 (1), 1-12 (2011).
  4. Sawcer, S., et al. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nature. 476 (7359), 214-219 (2011).
  5. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6 (11), 1398-1422 (2014).
  6. Balls, M. The origins and early days of the Three Rs concept. Altern Lab Anim. 37 (3), 255-265 (2009).
  7. Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
  8. Leahy, A. A., et al. Analysis of the trajectory of osteoarthritis development in a mouse model by serial near-infrared fluorescence imaging of matrix metalloproteinase activities. Arthritis Rheumatol. 67 (2), 442-453 (2015).
  9. Scales, H. E., et al. Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging. Rheumatology (Oxford). 55 (3), 564-572 (2016).
  10. Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circ Res. 100 (8), 1218-1225 (2007).
  11. Eaton, V. L., et al. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. J Neuroinflammation. 10, (2013).
  12. Kandagaddala, L. D., Kang, M. J., Chung, B. C., Patterson, T. A., Kwon, O. S. Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Exp Toxicol Pathol. 64 (1-2), 109-114 (2012).
  13. Wang, C., et al. In situ fluorescence imaging of myelination. J Histochem Cytochem. 58 (7), 611-621 (2010).
  14. Wang, C., et al. Longitudinal near-infrared imaging of myelination. J Neurosci. 31 (7), 2382-2390 (2011).
  15. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm. 113 (4), 477-485 (2006).
  16. Badawi, A. H., et al. Suppression of EAE and prevention of blood-brain barrier breakdown after vaccination with novel bifunctional peptide inhibitor. Neuropharmacology. 62 (4), 1874-1881 (2012).
  17. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  18. Lin, T. H., et al. Diffusion fMRI detects white-matter dysfunction in mice with acute optic neuritis. Neurobiol Dis. 67, 1-8 (2014).
  19. Knier, B., et al. Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 56, 34-44 (2015).
  20. Schellenberg, A. E., Buist, R., Yong, V. W., Del Bigio, M. R., Peeling, J. Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Magn Reson Med. 58 (2), 298-305 (2007).
  21. Mori, Y., et al. Early pathological alterations of lower lumbar cords detected by ultrahigh-field MRI in a mouse multiple sclerosis model. Int Immunol. 26 (2), 93-101 (2014).
  22. Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nat Med. 19 (9), 1161-1165 (2013).
  23. Theien, B. E., et al. Differential effects of treatment with a small-molecule VLA-4 antagonist before and after onset of relapsing EAE. Blood. 102 (13), 4464-4471 (2003).
  24. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  25. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. J Immunol. 182 (10), 5909-5913 (2009).
  26. Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS One. 7 (12), e50915 (2012).
  27. Bukilica, M., et al. Stress-induced suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the rat. Int J Neurosci. 59 (1-3), 167-175 (1991).

Tags

Medisin autoimmun encefalomyelitt multippel sklerose optikusnevritt optisk levende avbildning bioluminesens infrarød betennelse
Bioluminesens og nær-infrarøde Imaging av optikusnevritt og hjernebetennelse i EAE Modell av multippel sklerose i Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmitz, K., Tegeder, I.… More

Schmitz, K., Tegeder, I. Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (121), e55321, doi:10.3791/55321 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter