Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie
Summary
la régénération rétinienne Zebrafish a surtout été étudiée en utilisant des rétines fixes. Cependant, les processus dynamiques tels que la migration nucléaire interkinetic se produisent au cours de la réponse régénérative et nécessitent imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes sous-jacents. Ici, nous décrivons la culture et d'imagerie conditions pour surveiller Interkinetic Migration nucléaire (INM) en temps réel en utilisant la microscopie multiphoton.
Abstract
Un programme de régénération endogène est initiée par Müller glie dans le poisson zèbre adulte (Danio rerio) rétine après une lésion neuronale et la mort. Les gliales Müller ré-entrer dans le cycle cellulaire et produisent des cellules progénitrices neuronales qui subissent les rondes subséquentes de divisions cellulaires et se différencient en types de cellules neuronales perdues. Les deux Müller gliales et cellules progénitrices neuronales noyaux répliquent leur ADN et subissent une mitose dans des endroits distincts de la rétine, soit ils migrent entre la basale couche intérieure nucléaire (INL) et la couche extérieure nucléaire (ONL), respectivement, dans un processus décrit comme Interkinetic migration nucléaire (INM). INM a surtout été étudié dans la rétine en développement. Pour examiner la dynamique de l'INM chez l'adulte régénérant rétine zebrafish en détail, imagerie des cellules vivantes des cellules progénitrices marquées par fluorescence Müller glie / neuronales est nécessaire. Ici, nous fournissons les conditions pour isoler et rétines culture dorsalesde Tg [GFAP: NGFP] zebrafish de mi2004 qui ont été exposés à une lumière intense constante pendant 35 h. Nous montrons également que ces cultures rétiniennes sont viables pour réaliser des expériences d'imagerie en direct des cellules, l' acquisition en continu des images z-stack dans toute l'épaisseur de l'expiant rétinienne jusqu'à 8 h par microscopie multiphoton pour surveiller le comportement migratoire des GFAP: cellules -positifs NGFP . En outre, nous décrivons les détails pour effectuer une analyse post-imagerie pour déterminer la vitesse de l'INM apicale et basale. Pour résumer, nous avons établi des conditions pour étudier la dynamique de l'INM dans un modèle adulte de la régénération neuronale. Cela fera progresser notre compréhension de ce processus cellulaire crucial et nous permettre de déterminer les mécanismes qui contrôlent l'INM.
Introduction
Contrairement aux humains, le poisson zèbre (Danio rerio) présentent une réponse de régénération robuste sur la mort cellulaire des neurones rétiniens 1, 2, 3, 4. Le facteur α de nécrose tumorale, une molécule de signalisation qui est libérée de mourir neurones de la rétine induit Müller glie résidant dans l'basales couche intérieure nucléaire (INL) de la rétine, à proliférer 5 et de produire des cellules souches neuronales qui continuent à proliférer avant de se différencier en cellule neuronale les types qui sont morts 2, 3, 4. Au cours de la phase proliférative de la réaction de régénération, les noyaux des cellules gliales Müller et de leurs cellules progénitrices neuronales dérivées subissent un motif répétitif de migration en phase avec le cycle cellulaire (Interkinetic migration nucléaire, INM) 6 </sup > 7. Nuclei positionné dans le INL basale répliquer leur ADN avant de migrer vers la couche externe nucléaire (ONL) où ils se divisent avant les noyaux résultant retournent basally à l'INL. Ce processus a été décrit pour la première au cours du développement neuroépithélial utilisant des méthodes histologiques, alors que les approches d'imagerie en direct des cellules plus tard confirmé l'interprétation par Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Les deux approches d'imagerie histochimiques et des cellules vivantes ont été utilisées pour déterminer les mécanismes sous – jacents INM et sa fonction dans le développement neuroepithelia y compris la rétine 9, 11, 12, 13. Cependant, les mécanismes régissant INM chez l'adulte régénérant rétine n'a pas été étudiée en profondeurxref "> 6, 7. imagerie des cellules vivantes sera une approche précieuse pour faire progresser notre connaissance des voies de signalisation qui contrôlent l' INM chez l'adulte rétine régénération.
Jusqu'à récemment, l' imagerie des cellules vivantes de l' INM dans la rétine est limitée soit à des embryons de poisson zèbre vivants ou embryon de poulet ou de la souris postnatale explants rétiniens 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Alors que explants rétiniens provenant d' animaux adultes d'une variété d'espèces , y compris la souris, le rat et le poisson zèbre ont été utilisés pour la cellule différente des approches biologiques 17, 18, 19, 20, des expériences d'imagerie des cellules vivantes en utilisant des explants rétiniens have été limité à de brèves périodes de temps et n'ont pas été exécutées en continu pendant plusieurs heures 21, 22. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la culture adulte rétines poisson zèbre lumière endommagée pour effectuer des expériences d'imagerie des cellules vivantes INM de surveillance utilisant la microscopie multi-photon 6. Approches d'imagerie en direct des cellules sont avantageuses par rapport aux méthodes immunohistochimiques lors d' enquêtes sur les mécanismes de contrôle de l' INM, que la dynamique de l' INM, par exemple, les vitesses peuvent être affectées plutôt que l'emplacement de la mitose, ce qui pourrait potentiellement pas être détectée en utilisant immunocytochimie.
À l'avenir, cette méthode a aussi le potentiel d'être modifié pour étudier d'autres processus dynamiques au cours de la régénération de la rétine, comme la phagocytose de mourir photorécepteurs par Müller glie ou le comportement de la microglie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les études portant sur les mécanismes régissant la régénération de l'adulte endommagée de la rétine zebrafish méthodes principalement utilisées immunocytochimiques 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Mise en place des conditions de culture des explants rétiniens et d'effectuer l&#…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous apprécions le soutien fourni par William Archer et le Fonds Notre Dame imagerie intégrée. Des remerciements spéciaux sont dirigés vers les techniciens Freimann sciences de la vie pour leur aide continue et leur prise en charge et de l'élevage du poisson zèbre. Cette étude a été soutenue par des subventions du National Eye Institute des NIH pour DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) et le Centre de recherche Zebrafish, Université de Notre Dame, Notre Dame, IN.
Materials
| Dumont forceps size #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps size #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
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