Razionalizzato isolamento di singole cellule TCR e generazione di vettori retrovirali per In Vitro e In Vivo l'espressione del TCR umano
Summary
I combines di protocollo corrente singola cella coppia umana TCR alfa e beta catena sequenziamento con snella generazione di vettori retrovirali compatibile con espressione TCR in vitro e in vivo .
Abstract
Anche se, sono stati sviluppati diversi metodi per il sequenziamento di catene alfa e beta di accoppiati delle cellule T a ricevitore (TCR) da singole cellule di T, nessuno finora sono stati favorevoli a valle in vivo analisi funzionale di TCR eterodimeri. Abbiamo sviluppato un protocollo migliorato basato su una PCR multiplex-annidato in due fasi, che si traduce in un prodotto PCR che si estende su intere regioni variabili di un catene alfa e beta TCR di umane. Identificando i siti di restrizione unici e incorporare gli iniettori PCR, abbiamo fatto il prodotto PCR compatibile con Sub-clonazione diretta nel vettore retrovirale modello. Il costrutto retrovirale risultante consente di codificare un chimerico umano/mouse TCR con un dominio intracellulare del mouse, che è funzionale in cellule di topo o in modelli di topo in vivo . Nel complesso, il protocollo descritto qui combina umana singola cella accoppiato TCR alfa e beta catena identificazione con generazione ottimizzata di vettori retrovirali facilmente adattabile per espressione TCR in vitro e in vivo . Il video e il materiale di accompagnamento sono progettati per fornire una descrizione altamente dettagliata della singola cella PCR, cosicché i passaggi critici possono essere seguite e potenziali insidie evitati. Inoltre, forniamo una descrizione dettagliata dei passaggi clonazione necessari per generare il vettore di espressione. Una volta imparato, l’intera procedura da singola cella ordinamento all’espressione TCR potrebbe essere eseguita in un breve periodo di due settimane.
Introduction
T cell receptor (TCR) detta decisione di destino delle cellule T durante lo sviluppo, stato stazionario/omeostasi e stimolazione antigenica in periferia1,2,3. Recente espansione delle tecnologie di sequenziamento profondo ha scoperto una diversità TCR precedentemente poco apprezzata all’interno di risposte specifiche delle cellule di T di antigene. Diversità TCR suggerisce un potenziale per le risposte delle cellule T funzionalmente ampio. Al fine di integrare l’analisi di repertorio TCR sequenza con saggi funzionali TCR, gli approcci di sequenziamento dovrebbero essere progettati per essere compatibile con sistemi sperimentali e in vivo modelli utilizzati per la successiva analisi funzionale di select TCR. Abbiamo sviluppato un approccio efficace per l’isolamento di sequenza umana del TCR e razionalizzato Sub-clonazione in un vettore di modello TCR chimerico umano/mouse compatibile con espressione TCR in topi umanizzati HLA4. Isolamento delle relative catene alfa e beta del TCR heterodimeric richiede l’amplificazione di PCR di entrambe le catene da una singola cellula. Anche se, diversi protocolli clonazione di singole cellule TCR sono stati sviluppati e utilizzati, nessuno finora sono stati facilmente compatibile con alto-rendimento aerodinamico clonazione diretta di sconosciuto Vα/Vβ TCR in vettori retrovirali necessari per ri-espressione in vivo 4,5,6,7. Precedenti studi hanno utilizzato due approcci principali, sia per amplificare selettivamente una porzione limitata del TCR sufficiente per estrapolare la sequenza, o per amplificare l’intero TCR sequenza4,5,6 , 7. analisi funzionale a valle di TCR sequenze ottenute tramite il primo approccio richiede costose in silico un costruzione assemblaggio e de novo del TCR. Mentre il secondo approccio prevede la sequenza completa di TCR, regione costante umana non è compatibile con l’espressione in vivo del TCR clonato in modelli murini. Il nostro approccio è specificamente progettato per essere compatibile con in vivo analisi funzionale di TCR in modelli murini. Abbiamo sviluppato un’efficiente e snella singola cella protocollo PCR che consente per sub-clonazione diretta di frammenti PCR nel vettore di espressione di modello.
Il nostro approccio utilizza un’altamente sensibile reazione di PCR multiplex-nidificati che viene eseguita in due fasi. Nella prima reazione multiplex passo una piscina di 40 primer specifici per tutte le catene di V-beta e una piscina di 44 primer specifici per tutte le catene di V-alfa sono utilizzate per amplificare il TCR-alfa o TCR-beta senza la preventiva conoscenza della sequenza (tabella 1). Il primer forward ha una sequenza di adattatore, che è incorporata in 5′ del prodotto della PCR. Il primer reverse si basa sulla regione costante del TCR. Abbiamo identificato siti di restrizione unici che sono assente dal variabile umana o regioni della giunzione TCR e ha incluso tali in nuova e ridisegnata, TCRα e TCRβ primer (Figura 1). Nella seconda reazione nidificata, un primer specifico per la sequenza di adattatore e un primer reverse nidificato all’interno della regione costante sono utilizzati per amplificare ulteriormente le catene TCR con specificità aumentata (tabella 1, Figura 1). Dopo isolamento di singole cellule, due tondi di PCR (reazione prima con un pool di primer sia Vα e Vβ e in secondo luogo con gli iniettori adattatore) portano a un prodotto PCR che può direttamente essere sub-clonato nel vettore retrovirale modello. Il costrutto TCR finale codificherà, in una cornice unica lettura aperta (ORF), umane regioni variabili combinate con regioni costante del mouse collegate di sequenza della proteina ‘self-che fende’, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. La sequenza P2A è stata utilizzata nei sistemi multipli ed è stato ampiamente testata in modo specifico per l’espressione del TCR8,9,10,11. Anche se, dopo traduzione la maggior parte del P2A sequenza rimane attaccata al C-terminale della catena alfa collegato da un linker flessibile, mentre la sequenza di segnale catena beta ha un’ulteriore prolina, questa modifica non ha alcun effetto negativo sulla funzione TCR. La regione costante del mouse viene utilizzata nel costrutto anziché umani per evitare potenziali interazioni alterate con componenti di segnalazione a valle quando ri-espressa in cellule di topo. Il singolo ORF si tradurrà in espressione separata stechiometrico di alfa e beta catene9,11. Il protocollo attuale è basato su reagenti e approcci che sono ampiamente disponibili ed è stato progettato per essere eseguita in modo snello ed efficiente. Anche se abbiamo usato questa tecnica in particolare test TCR da cellule T autoreattive implicate nel diabete autoimmune, prevediamo che questo protocollo può essere ampiamente applicabile per l’identificazione e la valutazione funzionale di umano TCR specifico per epitopi autoimmuni, cancro epitopi o risposte a patogeni e vaccini.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel protocollo attuale, descriviamo un metodo efficiente per singola cella TCR amplificazione e successiva Sub-clonazione di accoppiati catene alfa e beta TCR in un vettore retrovirale espressione di modello. Anche se, sono stati sviluppati diversi protocolli di PCR di singola cellula, nessuno finora sono stati compatibili con immediata Sub-clonazione in un vettore di espressione. Nella maggior parte dei casi, una sequenza parziale che comprende le regioni CDR3 altamente variabile è amplificata, con abbastanza sequenza …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dal JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 pilota PJ e The Robert e Janice McNair Foundation.
Ringraziamo Sandra Pena e Andrene McDonald per il reclutamento dei pazienti, Samuel Blum per l’assistenza tecnica, Dr. George Makedonas per il dono di anticorpi e di controllo utilizzato per l’ottimizzazione di PCR del DNA.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
Riferimenti
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