단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화
Summary
단일 셀 쌍 인간의 TCR 알파와 베타 체인 시퀀싱과 현재 프로토콜 결합 유선형 retroviral 벡터 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 식와 호환의 세대.
Abstract
단 T 세포에서 쌍체 T 세포 수용 체 (TCR) 알파와 베타 체인의 시퀀싱에 대 한 여러 가지 방법을 개발 되었습니다, 하지만 아무도 지금까지 왔다 TCR heterodimers의 기능 분석에 다운스트림 도움이 vivo에서 . 우리 인간의 TCR 알파와 베타 체인의 전체 변수 영역에 걸쳐 PCR 제품 귀착되는 2 단계 멀티 플렉스 중첩 PCR에 기반으로 하는 향상 된 프로토콜을 개발 했습니다. 식별 하는 고유한 제한 사이트 PCR 뇌관으로 그들을 통합 함으로써, 우리는 만들어 PCR 제품 템플릿 retroviral 벡터에 직접 하위 복제와 호환. 결과 retroviral 구조 공상 인간/마우스 TCR 마우스 셀에서 또는 vivo에서 마우스 모델에서 작동 되는 마우스 세포내 도메인으로 인코딩합니다. 전반적으로, 여기에 설명 된 프로토콜 인간 단일 셀 쌍 TCR 알파와 베타 체인 식별 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 표현 위한 retroviral 벡터 쉽게 적응의 유선형된 세대와 결합 합니다. 중요 한 단계는 뒤 및 잠재적인 함정을 피할 수 있도록 비디오와 함께 제공 된 자료 PCR, 단일 셀의 매우 상세한 설명을 제공 하도록 설계 됩니다. 또한, 우리는 복제 식 벡터를 생성 하는 데 필요한 단계에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 일단 마스터, TCR 식 정렬 단일 셀에서 모든 절차는 짧은 2 주 기간에 수행 수 있습니다.
Introduction
T 세포 수용 체 (TCR) T 세포 운명 결정 개발, 안정 상태/항상성, 그리고 주변1,2,3항 원 자극 동안 지시. 깊은 기술을 시퀀싱의 최근 확장 이전 받는 TCR 다양성 내의 항 원 특정 한 T 세포 응답을 발견 했다. TCR 다양성 기능적으로 광범위 한 T 세포 응답에 대 한 잠재력을 제안합니다. TCR 시퀀스 레 퍼 토리 분석 TCR 기능적인 분석 실험, 통합 하려면 시퀀싱 방법 실험 시스템과 vivo 모델 선택의 후속 기능 분석에 대 한 활용에 호환 되도록 설계 되어야 한다 TCRs입니다. 우리 인간의 TCR 시퀀스 격리에 대 한 효율적인 접근 방식을 개발 하 고 하위 TCR 식 HLA humanized 쥐4와 호환 공상 인간/마우스 TCR 서식 파일 벡터에 클로닝 간소화. Heterodimeric TCRs의 해당 알파와 베타 체인의 절연 단일 셀에서 두 체인의 PCR 증폭을 해야합니다. 비록, 여러 단일 셀 TCR 복제 프로토콜 개발 되 고 활용, 아무도 지금까지 있다 높은 처리량 유선형 직접 복제의 알 수 없는 Vα/Vβ TCRs retroviral 벡터 재 식 vivo에서 필요한에 쉽게 호환 4,5,,67. 이전 연구 두 가지 주요 방법, 선택적으로 시퀀스를 추정 하거나 전체 TCR 시퀀스4,,56 증폭 충분 한 TCR의 일정된 부분을 증폭에 활용 , 7. 첫 번째 접근 방식을 통해 얻은 TCR 시퀀스의 하류 기능 분석 필요 비용 실리콘에 어셈블리와 드 노 보 의 건설에 TCR의. 두 번째 방법은 제공 하지만 완전 한 TCR 순서, 인간의 지속적인 지역 마우스 모델에서 복제 TCRs의 비보에 식이 호환 되지 않습니다. 우리의 접근 방식은 특히 vivo에서 기능 분석 TCRs의 마우스 모델에서 호환 되도록 설계 되었습니다. 우리는 효율적이 고 간소화 된 단일 셀 직접 서브 클로닝 PCR 파편의 템플릿 식 벡터에 대 한 수 PCR 프로토콜을 개발.
우리의 접근 방식을 매우 민감한 멀티 플렉스 중첩 PCR 반응이 두 단계에서 수행 되는 사용 합니다. 첫 번째 다중 반응에서 40 뇌관 모든 V 베타 체인에 대 한 특정의 수영장과 44 뇌관 V-알파 사슬 TCR 알파 또는 베타 TCR 시퀀스 (표 1)의 사전 지식 없이 증폭 하는 데 사용 됩니다 모든 특정의 수영장 단계. 앞으로 뇌관에는 5′ PCR 제품의 통합 어댑터 시퀀스를 있다. 반전 뇌관 TCR의 일정 영역을 기반으로 합니다. 우리가 확인 독특한 제한 사이트 인간의 변수 또는 접합 TCR 지역에서 결 석 하 고 새로 디자인 된 TCRα 및 TCRβ 뇌관 (그림 1)에이 통합. 두 번째 중첩 된 반응에서 어댑터 시퀀스에 대 한 특정 뇌관 및 일정 지역 내에서 중첩 된 역방향 뇌관 TCR 체인으로 증가 (표 1, 그림 1) 증폭에 사용 됩니다. 단일 셀 격리 후 PCR의 라운드 2 (첫 번째 반응 Vα와 Vβ 뇌관의 풀과 함께 두 번째 어댑터 뇌관) 수 직접 하위 복제 될 템플릿 retroviral 벡터에 PCR 제품에서 결과. 단 하나 열려있는 독서 프레임 (ORF), 마우스 일정 지역 ‘자체 cleaving’ 단백질 순서에 의해 연결 된와 함께 인간의 변수 영역에에서 최종 TCR 구문 인코딩할 것 이다 P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. P2A 시퀀스 여러 시스템에서 사용 되 고 특히 TCRs8,9,,1011의 표현에 대 한 광범위 하 게 테스트 되었습니다. 비록, P2A 시퀀스 남아의 대부분에 연결 후 번역의 알파 사슬의 베타 체인 신호 순서는 추가 프롤린,이 수정 유연한 링커로 연결 C terminus는 TCR 기능에 해로운 영향을 주지 않습니다. 마우스 일정 지역 하류 신호 구성 요소와 잠재적인 변경된 상호 작용을 피하기 위해 인간 대신 구문에 사용 됩니다 때 다시 마우스 세포에 표현. 단일 ORF 알파와 베타 체인9,11의 화학 량 론 별도 식에서 발생 합니다. 현재 프로토콜 시 약 및 널리 사용할 수 있는, 접근에 근거 하 고 간소 하 고 효율적인 방식으로 수행 하도록 설계 되었습니다. 비록 우리가 구체적으로 TCRs self-reactive T 세포 자가 면역 당뇨병에 연루에서 분석 결과를이 기술을 사용, 우리는이 프로토콜 식별 및 인간의 TCRs 대 한 특정의 기능 평가 대 한 광범위 하 게 적용 될 수 있습니다 예상 면역 epitopes, 암 epitopes, 또는 병원 균 및 백신에 대 한 응답.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 프로토콜에서 우리가 단일 셀 TCR 증폭 및 후속 하위 복제 쌍된 TCR 알파와 베타 체인의 템플릿 retroviral 식 벡터에 대 한 효율적인 방법을 설명 합니다. 비록, 여러 단 세포 PCR 프로토콜을 개발 하 고, 아무도 지금까지 있다 식 벡터에 즉시 하위 복제와 호환. 대부분의 경우, 높은 변수 CDR3 영역을 포괄 하는 부분 시퀀스는 증폭, 변수 영역을 추정 하는 것 충분 한 순서. 이 작은 PCR 제품 크기 높은 P…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, 이다 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 파일럿 PJ, 그리고는 로버트와 제 니스 맥 네 어 재단에 의해 투자 되었다.
우리는 산드라 페 냐와 Andrene 맥도날드 환자 모집, 새뮤얼 블 럼 박사 조지 Makedonas 항 체 및 제어 PCR 최적화에 사용 하는 DNA의 선물에 대 한 기술 지원에 대 한 감사.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
Riferimenti
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