Aerodinámico unicelular TCR aislamiento y generación de vectores retrovirales para In Vitro y In Vivo expresión de TCR humana
Summary
El actual combina protocolo célula emparejados humano TCR alfa y beta cadena secuenciación con optimiza generación de vectores retrovirales compatibles con expresión de TCR in vitro e in vivo .
Abstract
Aunque se han desarrollado varios métodos para la secuencia de pares T cell receptor (TCR) alfa y beta las cadenas de las células T, ninguno hasta ahora han sido propicias para abajo en vivo análisis funcional de TCR heterodímeros. Hemos desarrollado un protocolo mejorado basado en una PCR multiplex nested dos pasos, que se traduce en un producto PCR que se extiende por toda las regiones variables de un humano cadenas alfa y beta TCR. Por identificación de sitios de restricción únicos e incorporarlos en los iniciadores PCR, hemos hecho el producto PCR compatible con directa sub clonación en el vector retroviral de la plantilla. El constructo retroviral resultante codifica un quimérico humano/ratón TCR con un dominio intracelular de ratón, que es funcional en células de ratón o en modelos de ratón en vivo . En general, el protocolo descrito aquí combina humano unicelular emparejado TCR alfa y beta cadena identificación con generación optimizada de vectores retrovirales fácilmente adaptables para la expresión de TCR in vitro e in vivo . El video y el material que lo acompaña están diseñados para dar una descripción muy detallada de la célula PCR, para que los pasos críticos pueden ser seguidos y potenciales peligros evitar. Además, ofrecemos una descripción detallada de las medidas clonaje necesarias para generar el vector de expresión. Una vez dominado, todo el procedimiento de célula clasificación a expresión de TCR puede realizarse en un corto período de dos semanas.
Introduction
El receptor T (TCR) dicta decisión de destino de la célula de T durante el desarrollo, homeostasis de estado estacionario y estimulación antigénica en la periferia1,2,3. La reciente expansión de tecnologías de secuenciación profunda ha descubierto una diversidad TCR anteriormente subestimada en las respuestas de células T específicas de antígeno. Diversidad de los TCR sugiere un potencial de respuestas de células T funcionalmente amplia. Para integrar el análisis de repertorio TCR secuencia con análisis funcionales de TCR, los métodos de secuenciación deben ser diseñados para ser compatible con sistemas experimentales y en vivo los modelos utilizados para el posterior análisis funcional de selección TCR. Hemos desarrollado un enfoque eficiente para el aislamiento de secuencia TCR humano y racionalizar el clonación en un vector de plantilla TCR quimérico humano/ratón compatible con la expresión del TCR en ratones humanizados HLA4. Aislamiento de cadenas alfa y beta correspondientes de heterodiméricos TCRs requiere amplificación por PCR de dos cadenas de una sola célula. Aunque, varios protocolos de clonación de TCR unicelulares han sido elaborados y utilizados, ninguno hasta ahora han sido fácilmente compatible con alto rendimiento aerodinámico directa clonación de desconocido/Vβ Vα TCRs en vectores retrovirales necesarios para re-expresión en vivo 4,5,6,7. Estudios previos han utilizado dos enfoques principales, ya sea para amplificar selectivamente una porción limitada del TCR suficiente para extrapolar la secuencia, o para amplificar el TCR toda secuencia4,5,6 , 7. río abajo el análisis funcional de TCR secuencias obtenidas mediante la primera aproximación requiere costosas en silico Asamblea y novo de construcción del TCR. Mientras que el segundo enfoque proporciona la secuencia completa del TCR, la región constante humana no es compatible con la expresión en vivo de los TCRs clonadas en modelos de ratón. Nuestro enfoque está específicamente diseñado para ser compatible con en vivo análisis funcional de TCR en modelos de ratón. Hemos desarrollado una eficiente y ágil sola célula protocolo PCR que permite la directa sub clonación de fragmentos PCR en el vector de expresión de la plantilla.
Nuestro enfoque utiliza una muy sensible multiplex nested PCR reacción que se realiza en dos pasos. En la primera reacción multiplex paso una piscina de 40 cebadores específicos para todas las cadenas de beta V y una piscina de 44 cartillas específicas para todas las cadenas alfa de V se utilizan para amplificar la alfa de TCR o TCR-beta sin el conocimiento previo de la secuencia (tabla 1). El primer avance tiene una secuencia de adaptador, que se incorpora a los 5′ del producto PCR. El primer revés se basa en la región constante del TCR. Se han identificado sitios de restricción únicos que están ausente de variable humana o regiones de la ensambladura TCR e incorporado en el nuevo y rediseñado TCRα y TCRβ primers (figura 1). En la segunda reacción anidada, una cartilla específica para la secuencia del adaptador y una cartilla reversa anidada dentro de la región constante se utilizan para amplificar más lejos las cadenas TCR con mayor especificidad (tabla 1, figura 1). Después de aislamiento de células individuales, dos rondas de PCR (reacción primera con un grupo de iniciadores Vα y Vβ y la segunda con las cartillas de adaptador) resultan en un producto PCR que puede ser directamente los clonados en el vector retroviral de la plantilla. La construcción final del TCR a codificar, en un marco de solo lectura abierta (ORF), regiones variables humanos combinados con regiones constantes del ratón conectadas por el ‘Self-Hendedoras’ secuencia de la proteína, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. La secuencia de P2A se ha utilizado en múltiples sistemas y ha sido extensivamente probada específicamente para la expresión de TCR8,9,10,11. Aunque, después traducción en al mayoría de los restos de la secuencia de P2A el c-terminal de la cadena alfa conectada por un linker flexible, mientras que la secuencia de la señal de cadena beta tiene una prolina adicional, esta modificación no tiene ningún efecto perjudicial sobre la función TCR. La región constante del ratón se utiliza en la construcción en lugar de humanos para evitar potenciales interacciones alteradas con componentes de señalización corriente abajo cuando vuelva a expresado en células de ratón. El ORF solo resultará en expresión estequiométrica separado de las cadenas alfa y beta9,11. El protocolo actual se basa en los reactivos y los enfoques que están ampliamente disponibles y está diseñado para realizarse de manera ágil y eficiente. Aunque específicamente hemos utilizado esta técnica para análisis TCR de las células T auto reactivas implicadas en la diabetes autoinmune, Anticipamos que este protocolo puede ser extensamente aplicable para la identificación y evaluación funcional de TCR humano específico para epitopos autoinmune, cáncer epitopos o respuestas a patógenos y vacunas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el actual protocolo, describimos un método eficiente para la célula TCR amplificación y posterior sub clonación de las cadenas de alfa y beta TCR de pares en un vector de expresión retroviral de la plantilla. Aunque se han desarrollado varios protocolos PCR unicelular, ninguno hasta ahora han sido compatible con la inmediata sub clonación en un vector de expresión. En la mayoría de los casos, se amplifica una secuencia parcial que abarca las regiones CDR3 altamente variables, con suficiente secuencia para extr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por la JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, DK079638-05 de la P30 del NIH 5 PJ de piloto y el Robert y Janice McNair Foundation.
Agradecemos a Sandra Peña y Andrene McDonald para el reclutamiento de pacientes, Samuel Blum para asistencia técnica, el Dr. George Makedonas por el regalo de control utilizado para la optimización de la PCR de DNA y anticuerpos.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
Riferimenti
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