两个图像分析算法,“ 果蝇 NMJ形态特征”和“ 果蝇 NMJ布顿形态特征” 被创建 ,以自动量化果蝇神经肌肉接头(NMJ)九个形态特征。
突触形态是紧密相关的突触效能,并且在许多情况下,形态突触缺陷最终导致突触故障。 果蝇幼虫神经肌肉接头(NMJ),对谷氨酸突触一套行之有效的模式,已被广泛研究了几十年。导致NMJ形态缺陷的突变的鉴定表明,调节突触发育和功能基因库。许多这些在集中于定性的方法来检测果蝇 NMJ的形态异常的大规模研究,确定。定性分析的一个缺点是,很多细微的玩家奉献NMJ形态可能被忽视了。而需要定量分析检测微妙的形态差异,这样的分析还没有普遍执行,因为他们是勤劳的。该方案描述了详细的两个图像分析算法“ 果蝇 </em> NMJ形态特征”和‘ 果蝇 NMJ布顿形态特征’,可作为斐济兼容的宏,在果蝇 NMJ的定量,准确和客观的形态分析,这种方法被开发的分析与常用的标记免疫标记NMJ终端DLG-1和BRP此外,其广泛应用到其它标记物如HRP,CSP和嘉庆呈现在这个协议中的宏能够评估9个形态NMJ功能:。NMJ区域,NMJ周长,终扣的数目,NMJ长度,NMJ最长分支长度,岛数,分支数,分支点和在NMJ终端活性区的数目的数目。
认知障碍如智力障碍,孤独症谱系障碍和精神分裂症的特征通常在于异常突触功能1,2,3。突触的形态和功能是紧密相互交织的;形态缺陷会导致突触故障和,相反地,异常突触传递会影响突触成熟和形态4,5,6。
许多模式生物的人为了更好地理解突触生物学和突触的变化如何影响健康和疾病的7,8,9脑功能阐明了使用。 果蝇 NMJ是被广泛研究的和成熟的体内模型用于谷氨酸SYnapse生物10,11。在过去几十年里,这种模式已被用于生理和基因研究的重点,以及大规模的遗传筛选,目的是检测NMJs之间的形态差异。特别是,向前的遗传筛选已经鉴定了许多重要调节剂和机制突触发育底层和功能12,13,14,15,16。然而,大多数这些屏幕的依赖NMJ终端形态的视觉评估和突触异常的定性检测或很少形态特征半定量评分。因此,相当微妙的突触形态异常是不明显的人眼很容易错过。为了能够全面检测定量差异,NMJ必须由感兴趣的形态参数的定量系统进行精确评估。人工测量NMJ特征是费力的,尤其是当有感兴趣的几个NMJ特征和/或执行大规模的遗传筛选时。为了支持多参数,高通量的形态分析,并实现客观量化,两个宏“ 果蝇 NMJ形态特征”和“ 果蝇 NMJ布顿形态特征”被开发17。这两个宏在开源的图像分析软件斐济18运行,并且可以量化共焦和非共图像。
“果蝇 NMJ形态特征”的措施与突触后标记圆盘大-1(DLG-1)或突触前辣根过氧化物酶(HRP)进行免疫染色NMJ终端,共标记与活性区域标志bruchpilot(BRP)。它量化9个形态parameTER值(下面进一步描述):NMJ区域,NMJ周长,终扣的数目,NMJ长度,NMJ最长分支长度,岛的数,分支数,分支点和在突触终端活性区的数目的数目( 图1) 。虽然用于确定终扣的数目的算法存在于该宏,它不符合为精度17的标准。正确评估终扣的数目,有必要使用“ 果蝇 NMJ布顿形态测量”宏,它是专门设计来定量使用抗突触结合蛋白(嘉庆)或抗半胱氨酸字符串蛋白(CSP)进行免疫染色NMJ制剂终扣,和联合免疫标记与BRP。的“果蝇 NMJ布顿形态测量”宏量化参数如下:活性ZO的终扣的数目,NMJ布顿面积,NMJ长度,NMJ最长分支长度,岛数,分支数,分支点的数量和数目NES( 图2)。
宏包括3个子宏:(I)“转换为堆栈”标识所有可用的图像文件并创建Z-hyperstacks和两个通道的最大强度投影。作为输出,这个宏会产生每突触称为“stack_image_name”和“flatstack_image_name”两个新文件。 II)“定义ROI”将打开所有最大的投影图像“flatstack_image_name”连续,并用手动定义感兴趣区域(ROI),其中感兴趣的特定突触终端存在的区域中的请求呈现它们。这被实现以允许连接至相邻的肌肉和/或其它类型的突触终端(如1秒),可以存在于图像11突触排斥。 (III)“分析”用全自动化分析的图像的所有区域中的ROI的边界内。如此步骤的结果,用户将获得两个新文件:“RESULTS.TXT”,其中所有的数值测量将被注释,并且其中由宏产生的底层图像分割将被示出的“res_image_name.tif”。的NMJ轮廓,所述NMJ骨架,BRP-正极活性区的数目:在图像分析三种结构从每个突触终端的。所述NMJ轮廓被用于确定所述NMJ区域和其周边和随后的分水岭分离提供终扣的数目。从骨架,五个NMJ特征推导出:总NMJ长度,最长的连续路径连接任何两个端点的长度的总和(最长分支长度),每NMJ未连接的隔室的数目(以下称为“岛” ),支链的数量,和分支点(一个支化点连接三个或更多个分支)的数目。有源区的数目在BRP通道通过计数确定BRP-阳性斑点。带注释的NMJ轮廓(黄线)时,NMJ骨架(蓝线),和BRP-正极活性区域(由白色灶表示)的数目被显示在结果图像和参数的测量结果进行处理,以一个(。 TXT)输出文件( 图3)。
果蝇 NMJ形态特征”和‘ 果蝇 NMJ布顿形态特征’进行了首次描述,并通过Nijhof 等人 17广泛验证。这手稿着重于方法使用宏来分析NMJ形态‘ 果蝇 NMJ形态特征’和‘ 果蝇 NMJ布顿形态特征’。尽管如此,NMJ解剖和免疫染色需要之前宏辅助分析被执行。这是关键步骤,并且用于免疫组织化学标记物的组合,需要以适合于宏分析。简要地提及这些步骤本身此协议的ction 1和指导用户在详细描述的协议来执行这些程序的引用。
“ 果蝇 NMJ形态特征”和“ 果蝇 NMJ布顿形态特征”是感兴趣的评估突触形态研究人员的强大工具。 NMJ参数的手动评估是费力;据估计,宏会节省一个有经验研究者〜15分钟/ NMJ花费在手动图像分割。一到两打每个条件或基因型评估的突触,这种迅速总结了相当大量的节省了时间,甚至在小规模研究。当执行大屏幕,采用高通量分析,相比手动评估和量化的增益,可以是巨大的。除了增加的吞吐量,宏容易地提供目标数据;他们排除,否则需要蒙蔽实验以及当多个研究人员参与分析发生人际差异的个人偏见。最后,宏提供了一个敏感和准确的的NMJ功能alysis,从而导致比戏剧性NMJ缺陷相当微妙且迄今仍然在研究人员的眼睛赏识突触监管机构的鉴定。有关验证程序和在宏使用的算法的详细信息在出版物Nijhof 等中找到。 17。
宏的功能已经被验证在肌肉4.以适当地测量果蝇 NMJs的形态特征。随后,它证实了宏也适于分析在其它肌肉突触该生物体。它是可能的宏也可以被用于测量NMJ的形态学参数与其他物种中,包括其它果蝇和进一步昆虫类似的结构。即使NMJs在进化中非常遥远, 如小鼠NMJs,展现出非常相似的结构构象29。宏尚未在NMJ准备测试来自其他物种,但我们鼓励潜在用户测试宏用于上述目的。
这是非常重要的是,用户将探讨不同的自动阈值和算法来确定/选择图像最合适的宏设置。通过这些设置,当宏评估相比手动评估的大约95%的精确度得以实现。调整宏设置才能正常段的图像的100%,并且是非常费力或甚至不可能的过程。因此,如果它们的数量在5%以下,建议无法正常分割图像的排斥。显然,如果该图像的质量为低时,宏将产生不满意的图像分割的比例较高。低质量的图像同样会影响到人工评估,因此无法联系到宏的性能。尽管如此,宏是相当强大的,因为他们设计的图像S ON高含量显微镜(自动化荧光显微镜,其允许大量样品的成像)17产生。
一个关键的一点是,用户在视觉上检查由宏产生的所有结果的图像。这将允许检测并排除与不令人满意的分割画面。在这个协议中的部分6中,用户被引导如何在运行子宏时“分析”调整为正确的图像分割的设置。为了迅速与宏的要求以及如何调整宏设置了一个名为“Examples_adjusting宏设置”文件夹熟悉包含在宏库https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a。十三子文件夹,每个在不同的平台显微镜获得的(高含量/共焦/荧光显微镜)的例子的图像和不同的免疫染色中,提供了。甲PDF题为“范例指南”被包含在相同的其中提供对于每个实施例所需要的设置,与一个文本文档提供了预期的效果和结果图像一起夹。
宏被设计为.TIFF分开要处理的文件保存的图像,但是一些用户可能会以不同的格式保存其影像。下面的网站https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21包含一个名为“ 果蝇 NMJ”,其中三个示例文件(示例1 – 3)文件夹及文件“的例子指南”以详细说明如何将图像导入宏如果不是因为.TIFF分隔的文件存储也可以在同一个文件夹中找到。
总之,“ 果蝇 NMJ形态特征”和“ 果蝇 NMJ布顿形态特征”的宏量化十个不同的NMJ特性:NMJ面积,周长NMJ,终扣的数目,NMJ布顿区,NMJ长度,最长NMJ枝长,岛上的数NDS,分枝数,分枝点的数量和活动区域的数量。这提供了可评估只有一个或几个突触功能30,31,到目前为止可用的工具有很大的优势。多参数的定量分析,承担新的发现, 例如,巨大的潜力,以确定控制一个高达突触生物学的许多方面新的监管机构。它还提供所要求的分辨率确定coregulate完全相同的或重叠的NMJ特征,因此有可能在常见的分子途径来操作的基因。最后,它会打开的可能性,调查不受干扰的条件下17和基因确保这种协调的形态相关突触参数彼此多么的不同相关。
总之,该协议说明了如何使用两个宏“ 果蝇 NMJ形态特征”和“ 果蝇 NMJ布顿形态特征”,其在高通量的方式执行的10个形态NMJ特征客观和敏感定量。
The authors have nothing to disclose.
我们承认维也纳果蝇资源中心和布卢明顿果蝇股票中心(NIH P40OD018537)用于提供果蝇株。我们感谢来自显微成像中心杰克·弗兰森在成像专家支持。这项研究是由VIDI和荷兰科学研究组织(NWO)TOP补助(917-96-346,912-12-109),由德国智障网络支持由两个DCN / Radboud大学医学中心博士奖学金教育与研究部(BMBF)德国联邦财政部的NGFN +程序,并通过欧盟FP7大规模集成网络Gencodys(HEALTH-241995),以AS资助。该资助者在研究设计,数据收集和分析,决定发表或准备手稿没有作用。
Immunostainings | Dilution | ||
Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
Material | Company | Catalog number | Comments |
Equipment | |||
Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
Zeiss Axio imager | |||
Computer | Mac or Pc | ||
Material | Company | Catalog number | Comments |
Software | |||
FIJI |